Новый подход к диагностике эндотелиальной дисфункции у беременных

Введение / Introduction

Важным условием нормальной беременности является полноценное кровоснабжение плаценты и плода. Сосудистые нарушения определяют патогенез многих гестационных осложнений. Одну из ведущих ролей в развитии акушерской и перинатальной патологии в современной медицине отводят эндотелиальной дисфункции (ЭД), инициирующей развитие плацентарной недостаточности, преэклампсии, задержки роста плода и т. д. [1–3].

Нарушение имплантации в условиях ЭД в первые недели беременности представляет главную причину отсутствия эффекта проводимой терапии «больших акушерских синдромов» [4]. Современная медицина, несмотря на многочисленные исследования, к сожалению, обычно только констатирует развитие гестационных осложнений, а первичная профилактика зачастую отсутствует. Это определяет необходимость разработки инновационных диагностических стратегий раннего выявления сосудистых нарушений у беременных с целью своевременного начала профилактики и терапии.

В этой связи изучение функционального состояния эндотелия у беременных представляется важным элементом системного подхода в профилактике и снижении осложнений беременности.

На сегодняшний день в медицинской науке общепризнаны 3 направления диагностики ЭД:

1. биохимический анализ крови или мочи для выявления маркеров ЭД (оксид азота и его метаболиты, эндотелин-1, высокочувствительный С-реактивный белок (англ. high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP), гомоцистеин, фактор фон Виллебранда (англ. von Willebrand factor, vWF), микроальбуминурия (МАУ) и т. д.);
2. функциональные методы исследования, направленные на определение тонуса периферических сосудов и скорости кровотока, в том числе с применением фармакологических проб;
3. цитологическое исследование циркулирующих эндотелиоцитов – определение концентрации десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в периферической крови.

Немаловажно, что спектр методов оценки эндотелиальной функции, допустимых для использования в акушерской практике, ограничен. Значительная часть биохимических маркеров, традиционно применяемых для косвенной оценки состояния эндотелия, демонстрирует вариабельность концентрации, обусловленную даже нормальным физиологическим течением гестации, что снижает их достоверность для диагностики искомой патологии. Функциональная диагностика поражения эндотелия также имеет значимые ограничения в акушерской практике. Перестройка сердечно-сосудистой системы во время беременности требует коррекции полученных результатов функциональных тестов, а применение фармакологических проб ограничено из-за нежелательного влияния на плод.

Цитологическое исследование функции эндотелия осуществляется путем подсчета циркулирующих в периферическом кровотоке ДЭК. В норме количество ДЭК в периферическом кровотоке незначительно: обновление интимы сосудов протекает медленно, а эндотелиоциты после десквамации разрушаются макрофагальной системой печени, селезенки и легких. Время циркуляции ДЭК в кровотоке может достигать 42 часов [5]. Доказано повышение количества ДЭК в сыворотке периферической крови при заболеваниях, сопровождающихся повреждением сосудистой стенки: при сахарном диабете, нарушениях мозгового кровообращения, васкулитах, септических состояниях и т. п. [6][7]. Микроскопически ДЭК представляют собой плоские клетки с выраженной морфологической вариабельностью диаметром 10–50 мкм и толщиной 1–2 мкм. Способ подсчета ДЭК был впервые описан и внедрен J. Hladovec в 1978 г. [8]. Метод предполагает визуальный подсчет ДЭК и определение их количества на единицу объема плазмы.

Традиционная цитологическая диагностика поражения эндотелия обладает рядом важных преимуществ, включая его минимальную инвазивность и простую воспроизводимость. С другой стороны, нельзя не отметить некоторую вариативность референсных значений диагностического метода. В разработанном методе эндотелиальная дисфункция диагностируется при показателе количества ДЭК > (2–6)×10⁴ клеток на 100 мл плазмы. Позже, при исследованиях с использованием цитологического метода диагностики ЭД референтный показатель количества ДЭК также не был четко определен: (2–4)×10⁴ клетки на 100 мл как нормальное состояние сосудистой стенки в исследованиях В.С. Савельева и В.А. Петухова (2012) [9]; 7×10⁴ клеток на 100 мл как показатель ЭД в работе П.Е. Асташева и В.Г. Гудымовича (2011) [10]; 2×10⁴ клетки на 100 мл – референсный показатель нормального состояния эндотелия в работе F. Dignat-George с соавт. (2004) [11]. Объяснением такой вариативности искомого показателя может являться техника получения ДЭК из цельной крови, которая не исключает погрешности в приготовлении стандартного раствора плазмы для подсчета эндотелиоцитов в цитометрической камере. Помимо этого, метод, разработанный J. Hladovec (1978), не учитывает вариабельность ДЭК. В научных работах, использующих этот метод диагностики ЭД, встречается описание «клеток-предшественников», апоптозных клеток [12], «зрелых» клеток [13] и т. д. Вариабельность размера и формы ДЭК, возможно, определяют субъективизм исследователя в определении количества клеток в цитометрической камере, что не может не влиять на точность данного диагностического подхода. Основным механизмом деструкции эндотелиальных клеток является апоптоз [14], что и определяет морфологическую неоднородность ДЭК: в процессе гибели объем цитоплазмы и ядра клетки уменьшаются, геометрия клетки изменяется. В научной литературе изучению морфометрии ДЭК посвящены единичные работы. В 2008 г. В.И. Козловский с соавт. с применением световой микроскопии провели морфологическое исследование циркулирующих ДЭК при гипертонической болезни [5]. В исследовании выявлено увеличение концентрации циркулирующих клеток эндотелия с признаками апоптоза в группе пациентов с гипертонической болезнью. В 2008 г. A. Woywodt с соавт. с применением флуоресцентного окрашивания проводили маркировку ДЭК: определялось отношение циркулирующих клеток с апоптозом к «клеткам-предшественникам» (СD-146/CD-34), что определяло наличие ЭД [15]. P. Mancuso с соавт. в 2009 г. с применением проточной цитометрии проводили определение количества «зрелых» циркулирующих в кровотоке клеток, при этом ДЭК с «изменением геометрии» исключались из исследования [13]. Научные работы с использованием морфометрии циркулирующих эндотелиоцитов для диагностики ЭД у беременных в литературе не представлены. Тем не менее позиционирование исследования морфологии ДЭК как важного дополнительного инструмента для оценки функционального состояния эндотелия может определять инновационный вектор поиска маркеров сосудистых нарушений у беременных с целью профилактики гестационных осложнений.

Цель: совершенствование диагностики сосудистых нарушений во время беременности с использованием морфометрического исследования ДЭК.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

Проспективное наблюдательное исследование функционального состояния эндотелия во время беременности проведено методом «случай-контроль». В исследование было включено 180 женщин в I триместре беременности.

В работе применен новый метод диагностики дисфункции эндотелия, основанный на морфометрии ДЭК и определении их среднего эквивалентного диаметра (СДДЭК). СДДЭК – это одномерная (линейная) величина, характеристика оптического объекта на плоскости, определяемая расстоянием между двумя максимально удаленными точками контура данного объекта.

Анализ морфологии цитологических препаратов осуществлялся с применением стандартного раствора ДЭК, приготовленного по методике J. Hladovec (1978).

Исследовательский протокол / Study protocol:

1. центрифугирование венозной крови (10 минут при скорости 1000 оборотов в минуту);
2. помещение 1 мл полученной после центрифугирования плазмы в пластиковую пробирку, содержащую 0,1 мл раствор 0,1 % АДФ;
3. центрифугирование раствора (10 минут при скорости 2000 оборотов в минуту);
4. помещение 0,2 мл полученного супернатанта (надосадочной жидкости) в камеру Горяева (цитометрическая камера) (рис. 1);
5. морфометрия ДЭК с определением эквивалентного диаметра клеток. Рекомендуется использование оптического (светового) микроскопа с номинальным увеличением ×600, с целью метрологии может быть использован микрометр для светового микроскопа с оптическим разрешением 0,01 мм после соответствующей калибровки, либо специализированная морфометрическая компьютерная программа;
6. расчет СДДЭК по формуле: СДДЭК= ∑ЭДДЭК/∑ДЭК, где ∑ЭДДЭК – сумма показателей эквивалентного диаметра исследованных ДЭК; ∑ДЭК – количество исследованных ДЭК. Количество исследованных клеток ∑ДЭК не должно быть < 10, так как количество элементов в выборочной совокупности определяет точность искомого среднего значения. При оценке состояния эндотелия у беременных показатель СДДЭК > 30 мкм коррелирует с нормальным функциональным состоянием эндотелия; значение СДДЭК ≤ 30 мкм свидетельствует о развитии дисфункции эндотелия у беременных.

Группы обследованных / Study groups

Апробация предлагаемого способа диагностики ЭД во время беременности проведена на кафедре акушерства и гинекологии стоматологического факультета ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» на базе ГБУЗ «ГКБ им. В.П. Демихова, филиал № 1» ДЗМ. Выборка участниц включала 180 женщин в I триместре: основная группа – 90 человек с подтвержденным диагнозом неразвивающейся беременности; контрольная группа – 90 пациенток с неосложненным течением беременности, госпитализированных для проведения медицинского аборта. Неразвивающаяся беременность – необратимое проявление дезорганизации маточно-плодовых отношений; использование данной нозологии в качестве модели сосудистых нарушений у беременных позволило нам провести оценку и определить достоверность нового морфометрического метода диагностики ЭД.

Методы исследования / Study methods

У участниц исследования проведена комплексная диагностика ЭД с применением цитологических и биохимических маркеров поражения эндотелия. В работе проводилось определение в сыворотке крови концентрации hs-CRP методом иммунотурбодиметрии с латексным усилителем и vWF методом иммуноферментного анализа, а также концентрации альбумина в моче – определение МАУ методом иммунотурбидиметрии. Цитологическое исследование ЭД включало определение количества ДЭК по методу J. Hladovec (1978): у всех беременных проведена морфометрия ДЭК с определением СДДЭК по описанной выше методике с помощью микроскопа Leica DM1000 и компьютерной видеоприставки с интегрированной системой обработки и анализа изображений Leica Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. (компания Leica Microsystems, ЕС).

Статистический анализ / Statistical analysis

Для математической обработки полученных данных применялись следующие программы: Statistica (StatSoft Inc.), Excel (Microsoft) и SAS JMP (JMP SAS Institute). В работе рассчитаны: средняя арифметическая (M), стандартная ошибка (m) и вариативность (v). Непараметрические величины анализировались по критерию Манна–Уитни. Количественные величины представлены средним показателем и стандартным отклонением. Обнаружение и расчет корреляции осуществлялись с использованием непараметрического анализа Спирмена. При определении статистической значимости допускалась ошибка p < 0,05.

Результаты / Results

В основной группе (с неразвивающейся беременностью) средний возраст составил 30,9 ± 2,62 лет, в контрольной группе (с физиологическим течением беременности) – 31,4 ± 2,12 лет. Статистический анализ наличия сопутствующей патологии не показал значимых различий в группах участниц. Так, при исследовании антропометрических показателей получены следующие результаты: в основной группе ожирение выявлено в 36 % (n = 40), в группе контроля – в 30 % (n = 27) (р > 0,05).

Подсчет количества ДЭК продемонстрировал статистически значимые различия в группах (p < 0,001): 5,5×10⁴ клеток/100 мл в контрольной группе и 12,6×10⁴ клеток/100 мл в основной группе. Разработанный нами морфометрический метод диагностики поражения эндотелия продемонстрировал также статистически значимые результаты сравнения показателей функции эндотелия у участниц: СДДЭК в основной группе составил 29,5 ± 9,40 мкм, что оказалось значимо меньше (p < 0,001) показателя контрольной группы – 43,9 ± 3,99 мкм (рис. 2).

Для подтверждения достоверности разработанного метода диагностики мы исследовали в группах участниц биохимические маркеры поражения эндотелия: определяли концентрацию в сыворотке крови hs-CRP, vWF, а также количество альбумина в моче (табл. 1). Результаты продемонстрировали значимые различия в группах беременных. Срыв компенсаторных возможностей эндотелиоцитов, ведущий к ЭД, нарушает сосудистый гомеостаз, запуская цепь патологических процессов в кровеносном русле. Это потенцирует нарушение маточно-плодовых отношений, что в финале приводит к неразвивающейся беременности, и продемонстрированные показатели биохимических параметров в группах участниц свидетельствуют об этом.

С целью валидации рассматриваемой гипотезы прогностической значимости СДДЭК в обнаружении патологии эндотелиальной системы был осуществлен расчет корреляционных отношений показателей СДДЭК и количества ДЭК. Математический анализ проводился по показателям основной группы, так как в ней был больший разброс изучаемого параметра. В результате продемонстрирована сильная корреляция рассматриваемых цитологических показателей, при этом расчет показал обратную зависимость r_s = –0,95 (рис. 3).

Результаты расчета корреляции СДДЭК и биохимических маркеров поражения эндотелия представлены на рисунке 4. Анализ концентрации hs-СRP также продемонстрировал высокий уровень корреляции с примененным нами морфометрическим параметром СДДЭК (r_s = –0,91). Расчет корреляции МАУ и СДДЭК, а также vWF и СДДЭК также показал значимые результаты, демонстрируя умеренную отрицательную связь, соответственно –0,72 и –0,69.

Ниже представлены клинические случаи с применением разработанного метода морфометрической диагностики дисфункции эндотелия у беременных.

Клинический случай 1 (основная группа) / Clinical case 1 (main group)

Пациентка 1. Возраст 27 лет. Диагноз: Неразвивающаяся беременность 8 недель. Беременность третья (роды 2). Перенесенные заболевания: мочекаменная болезнь, острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ), детские инфекции. Ультразвуковое исследование (УЗИ): Анэмбриония на сроке 6–7 недель. Лабораторное исследование: МАУ – 0,015 мкг/мл, vWF – 112,4 %, hs-CRP – 3,9 мг/л; количество ДЭК – 22×10⁴ клеток/100 мл, СДДЭК – 20 мкм. Заключение: лабораторные признаки ЭД.

Клинический случай 2 (основная группа) / Clinical case 2 (main group)

Пациентка 2. Возраст 31 год. Диагноз: Неразвивающаяся беременность 10 недель. Беременность пятая (роды 1, аборты 4). Сопутствующие и перенесенные заболевания: хронический эндометрит, хронический сальпингоофорит, ОРВИ, детские инфекции. УЗИ: Неразвивающаяся беременность 9 недель. Результаты лабораторного исследования: МАУ – 0,03 мкг/мл, vWF – 105,9 %, hs-CRP – 5,1 мг/л, количество ДЭК – 8×10⁴ клеток/100 мл, СДДЭК – 18 мкм. Заключение: лабораторные признаки ЭД.

Клинический случай 3 (контрольная группа) / Clinical case 3 (control group)

Пациентка 3. Возраст 35 лет. Диагноз: Беременность 8 недель. Госпитализирована для проведения медицинского аборта. Беременность седьмая (роды 3, аборты 3). Перенесенные заболевания: детские инфекции, ОРВИ. УЗИ: Беременность 8 недель, прогрессирующая. Результаты лабораторного исследования: МАУ – 0,015 мкг/мл, vWF – 106,7 %, hs-CRP – 1,8 мг/л, количество ДЭК – 5×10⁴ клеток/100 мл, СДДЭК – 40 мкм. Заключение: лабораторных признаков ЭД нет.

Клинический случай 4 (контрольная группа) / Clinical case 4 (control group)

Пациентка 4. Возраст 36 лет. Диагноз: Беременность 9–10 недель. Госпитализирована для проведения медицинского аборта. Беременность пятая (роды 2, аборты 2). Сопутствующие заболевания: хронический гастрит, ОРВИ. УЗИ: Беременность 9 недель прогрессирующая. Результаты лабораторного исследования: МАУ – 0,015 мкг/мл, vWF – 105,7 %, hs-CRP – 2,1 мг/л, количество ДЭК – 13×10⁴ клеток/100 мл, СДДЭК – 40 мкм. Заключение: лабораторных признаков ЭД нет.

Обсуждение / Discussion

В работе проведен анализ функционального состояния эндотелия во время беременности с использованием традиционного метода выделения циркулирующих ДЭК. Применен новый способ диагностики ЭД у беременных с использованием морфометрического исследования – метода, позволяющего оптимизировать обнаружение сосудистых нарушений и обладающего существенным преимуществом – малоинвазивностью и простотой выполнения. Научные исследования с анализом цитометрических показателей ДЭК немногочисленны, тем не менее морфометрия эндотелиальных клеток может являться перспективным вектором поиска новых маркеров нарушения сосудистой системы. Фиксация морфологических изменений эндотелиальных клеток, являющихся лабильными биологическими структурами, может представлять дополнительный информативный фактор обнаружения циркуляторных нарушений. В литературном обзоре S. Schreier и W. Triampo (2020) указывается: «изучение циркулирующих клеток выводит клеточную жидкостную биопсию на новый уровень диагностического поиска в качестве экономичной и малоинвазивной альтернативы выявления нарушений системного кровотока, осуществляя междисциплинарный поиск новых биомаркеров сосудистой патологии» [7].

В результате проведенного нами исследования состояния эндотелия у беременных получены значимые отличия по традиционному цитологическом маркеру поражения эндотелия – количеству ДЭК в периферической крови: этот показатель продемонстрировал достоверное увеличение (p < 0,001) циркулирующих клеток в группе пациенток с неразвивающейся беременностью (12,6 ± 5,89 ×10⁴ клеток/100 мл) по сравнению с контрольной группой (5,5×10⁴ клеток/100 мл). Использованный нами новый морфометрический показатель – СДДЭК также показал статистически значимое различие в группах (p < 0,001): его величина в контрольной группе была выше и составила 43,9 ± 3,99 мкм, в группе с неразвивающейся беременностью (основная группа) этот показатель составил 29,5 ± 9,40 мкм.

Апоптоз, как основной механизм деструкции эндотелиоцитов [14], изменяет геометрическую форму клетки, которая проходит стадии конденсации и фрагментации. Следует указать, что при проведении морфометрии ДЭК в нашем исследовании фиксировались участки маргинации, фрагментации и компактизации хроматина ДЭК (рис. 1), что подтверждает роль апоптоза в генезе ЭД, а также позиционирует данное исследование в качестве перспективного направления поиска маркеров сосудистых поражений на молекулярном уровне.

Были исследованы корреляционные отношения разработанного нами морфометрического показателя СДДЭК и традиционных маркеров нарушения эндотелиального аппарата – количества ДЭК и биохимических показателей поражения эндотелия. Коэффициент Спирмена продемонстрировал сильный уровень корреляции между количеством ДЭК и их средним диаметром (r_s= – 0,95), а также с показателем hs-CRP (r_s = – 0,91). Со значениями vWF и МАУ показатель СДДЭК продемонстрировал умеренную корреляционную зависимость: r_s= – 0,69 и rs = – 0,72. При этом отрицательное значение параметров свидетельствует об обратной зависимости показателей: увеличение количества ДЭК, а также повышение концентрации биохимических маркеров ЭД сопровождалось уменьшением их среднего эквивалентного диаметра, что является подтверждением деструктивных изменений в эндотелии. Таким образом, морфометрия ДЭК детально анализирует деструкцию клеток, являясь цифровой оценкой поражения сосудистой стенки, а точнее, активности апоптоза в изучаемой ткани.

Полученные результаты статистического анализа позволили применить разработанный метод в клинической практике. В представленных клинических примерах высокая степень вариабельности традиционного маркера ЭД – количества ДЭК (от 5×10⁴ до 13×10⁴ клеток/100 мл в группе с нормальным течением беременности и от 6×10⁴ до 22×10⁴ клеток/100 мл в группе с неразвивающейся беременностью) не показали информативности в диагностическом поиске. При этом примененный нами морфометрический параметр СДДЭК показал диагностическую эффективность: СДДЭК ≤ 30 мкм в группе с неразвивающейся беременностью (основная группа) и СДДЭК > 30 мкм в контрольной группе. Исследование биохимических маркеров у участниц основной группы определило наличие у них ЭД, что также подтверждает диагностическую ценность нового морфометрического метода в обнаружении сосудистых нарушений.

Заключение / Conclusion

Морфологическое исследование эндотелиоцитов обладает значительным потенциалом в качестве эффективного диагностического теста для оценки функционального состояния эндотелия. Представленная разработка является малоинвазивным, быстровыполнимым, технически и экономически доступным методом исследования эндотелия у беременных, который может быть использован в качестве инструмента ранней пренатальной диагностики. Разработанный морфометрический метод диагностики ЭД у беременных позволяет на клеточном уровне обнаруживать изменения в кровотоке, определяя перспективы совершенствования ранней диагностики гравидарных осложнений, тем самым расширяя возможности эффективного снижения гестационных потерь.