Интегративная модель цервикального ремоделирования: взаимосвязь ультразвуковых, иммунных и микробиологических маркеров

Введение / Introduction

Созревание шейки матки является ключевым этапом подготовки организма к родам и представляет собой сложный многофакторный процесс, включающий структурную перестройку внеклеточного матрикса, изменение архитектоники коллагеновых и эластиновых волокон, снижение механической жесткости ткани и усиление васкуляризации. Нарушение временной координации этих процессов может приводить к преждевременному ремоделированию шейки матки, которое рассматривается как один из патогенетических механизмов самопроизвольных преждевременных родов и функциональной цервикальной недостаточности [1–3].

Современные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что процессы цервикального созревания сопровождаются активацией воспалительных сигнальных путей независимо от срока родоразрешения. При доношенной беременности основными триггерами выступают механическое растяжение тканей, гормональные сигналы плода и плаценты, а также активация транскрипционных факторов воспаления – ядерного фактора каппа-B (англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB) и активаторного белка-1 (англ. activator protein-1, AP-1). При преждевременных родах ведущую роль часто играют инфекционные агенты, что приводит к активации врожденного иммунитета, продукции цитокинов — интерлейкина-6 (англ. interleukin, IL), IL-8, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (англ. granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) и хемокинов, а также к инфильтрации шейки матки нейтрофилами и макрофагами. В обоих случаях конечным этапом является деградация коллагена и снижение механической
прочности шейки матки, но источники медиаторов и клеточные эффекторные механизмы различаются [4][5]. Вместе с тем вклад отдельных молекулярных медиаторов, гормональных факторов соединительнотканного метаболизма и микробиоценоза цервикального канала в формирование фенотипов зрелости шейки матки остается недостаточно изученным [6][7].

В исследовании S. Lu с соавт. (2021), посвященном анализу вагинальной микробиоты у первородящих женщин с различной степенью зрелости шейки матки, показано, что по мере увеличения степени ее размягчения наблюдается тенденция к снижению разнообразия мик­робных видов. Авторы предполагают, что взаимодействие микроорганизмов внутри микробного сообщества может способствовать увеличению доли Lactobacillus iners, что потенциально связано с более выраженными процессами ремоделирования цервикальной ткани. При сравнительном анализе микробных сообществ установлено, что при большей степени зрелости шейки матки чаще выявлялись бактерии рода Sphingomonas, тогда как при низкой степени зрелости отмечалось сочетанное присутствие как комменсальных, так и условно-патогенных микроорганизмов. При этом существенных различий во внутривидовом и межвидовом разнообразии микробиоты между группами выявлено не было, а общий таксономический состав вагинальной микробиоты оставался сходным [8].

Таким образом, различные степени зрелости шейки матки не обязательно сопровождаются формированием специфических микробных фенотипов. Вероятно, микробиота выступает не самостоятельным детерминантом фенотипа цервикальной зрелости, а модифицирующим фактором, влияющим на процессы ремоделирования. Предполагается, что изменения микробного сообщества могут реализовывать свое влияние не столько через выраженный воспалительный ответ, сколько через регуляцию матрикс-ремоделирующих путей, включая активацию матриксных металлопротеиназ.

Кроме того, ряд исследований показывают, что наиболее выраженные различия вагинальной микробиоты наблюдаются преимущественно на ранних сроках гестации, тогда как в поздние сроки беременности и непосредственно перед родами микробное сообщество остается относительно стабильным [8].

В связи с этим представляется перспективным мультипараметрический подход, основанный на стратификации фенотипов зрелости шейки матки по данным эластографии с последующей оценкой локальных маркеров. Такая стратегия может способствовать более раннему выявлению преждевременного ремоделирования – состояния, при котором признаки функциональной зрелости формируются до физиологического срока родов и ассоциированы с повышенным риском спонтанных преждевременных родов.

Цель: охарактеризовать фенотипы зрелости шейки матки, выделенные кластерным анализом параметров ультразвуковой цервикометрии и эластографии, путем оценки взаимосвязей локальных иммунологических и микробиологических маркеров цервикального ремоделирования.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

Проведено одноцентровое проспективное когортное исследование на базе ФГБНУ НИИ АГиР им. Д.О. Отта в период с мая 2023 г. по май 2025 г. В исследование включены 82 беременные III триместра беременности. Всем пациенткам была выполнена ультразвуковая фенотипизация степени зрелости шейки матки с использованием методов количественной эластографии E-Cervix (Samsung Medison, Республика Корея). Проведена оценка иммунологических и микробиологических маркеров, потенциально отражающих процессы созревания и ремоделирования шейки матки, в зависимости от выявленного фенотипа зрелости.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения: возраст 18–42 года; женщины с одноплодной спонтанно наступившей беременностью, находившиеся в III триместре; при интактных плодных оболочках, у которых родоразрешение произошло через естественные родовые пути; беременные, родоразрешенные путем кесарева сечения после начала родовой деятельности на фоне биологической готовности родовых путей; подписанное добровольное согласие.

Критерии исключения: возраст менее 18 и более 42 лет; женщины с многоплодной беременностью, клиническими признаками преждевременного разрыва плодных оболочек, вагинальными кровотечениями; наличие цервикального шва (серкляжа) или установленного акушерского разгружающего пессария; онкологические заболевания; ранее перенесенные объемные хирургические вмешательства на шейке матки; умеренные и тяжелые формы преэклампсии (ПЭ); сахарный диабет; преиндукция родов; отказ от участия в исследовании.

Группы обследованных / Study groups

На основании ранее разработанного кластерного алгоритма оценки параметров цервикометрии и эластографии E-Cervix пациентки были распределены на 3 фенотипические группы зрелости шейки матки: фенотип 1 – «незрелая шейка матки» (n = 21), фенотип 2 – «созревающая шейка матки» (n = 31), фенотип 3 – «зрелая шейка матки» (n = 30). Дальнейший анализ иммунологических и микробиологических показателей проводили с учетом указанной фенотипической стратификации.

Методы исследования / Study methods

Получение клинического материала / Clinical sample collection

Клинический материал из цервикального канала получали в утренние часы (с 7:00 до 9:00) до выполнения ультразвукового исследования (УЗИ) с эластографией в течение текущих суток. Перед взятием материала выполняли визуализацию шейки матки в зеркалах. Экзоцервикс предварительно очищали от избыточного влагалищного секрета стерильным тампоном без использования антисептических растворов во избежание контаминации и повреждения эпителия. Слизь из цервикального канала не удаляли с целью сохранения нативного состава исследуемого материала. Отделяемое цервикального канала получали с соблюдением правил асептики с использованием эндоцервикальной цитологической щетки (англ. cytobrush), которую вводили в цервикальный канал на глубину 1,0–1,5 см с последующим вращательным движением на 360°.

Полученный клинический материал помещали в 500 мкл стерильного 0,9 % раствора хлорида натрия, содержащего ингибитор протеаз (Sigma, США), и интенсивно встряхивали. После этого раствор хлорида натрия с цервикальным отделяемым центрифугировали 10 минут при 2400 g, отбирали супернатант, аликвоты которого хранили при –80 °C до проведения исследования.

Проведение лабораторного исследования / Laboratory testing

Для оценки локального иммунного ответа слизистой цервикального канала отделяемое цервикального канала помещали в пробирки с 500 мкл раствора для стабилизации РНК. Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с использованием набора реагентов «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с дальнейшим проведением реакции обратной транскрипции в соответствии с инструкцией к тест-системе ИммуноКвантекс (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Определяли уровень экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета – IL-1β, IL-10, IL-18, TNF-α (англ. tumor necrosis factor alpha; фактор некроза опухоли-α), TLR4 (англ. toll-like receptor 4; toll-подобный рецептор 4-го типа), GATA3 (англ. GATA binding protein 3; GATA-связывающий белок 3), CD68 (англ. cluster of differentiation 68; кластер дифференцировки 68), B2M (англ. β₂-microglobulin; β₂-микроглобулин) и получали заключение о наличии или отсутствии локальной воспалительной реакции на основании автоматического расчета индекса воспаления тест-системой ИммуноКвантекс (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Для постановки реакции использовали детектирующие амплификаторы «DTprime 5» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Исследование микробиоценоза цервикального канала выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием тест-системы «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Исследуемым материалом служило отделяемое цервикального канала, которое брали стерильным зондом и помещали в транспортную среду. С помощью теста «Фемофлор-16» определяли общую концентрацию бактериальной ДНК и концентрацию (абсолютную и относительную) следующих микроорганизмов: Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Streptococcus, Staphylococcus, Gardnerella vaginalis / Prevotell abivia / Porphyromonas, Eubacterium, Sneathia / Leptotrichia / Fusobacterium, Megasphaera / Veillonella / Dialister, Lachnobacterium / Clostridium, Mobiluncus / Corynebacterium, Peptostreptococcus, Atopobium vaginae. Кроме того, оценивали абсолютную концентрацию Mycoplasma hominis, Ureaplasma, Candida и наличие/отсутствие Mycoplasma genitalium. Получали автоматическое заключение оценки состояния микробиоценоза (нормоценоз, умеренный или выраженный дисбиоз). Определяли общую бактериальную массу (ОБМ) и количество Lactobacillus и рассчитывали соотношение Lactobacillus/ОБМ для оценки состояния микробиоценоза (нормоценоз или дисбиоз).

Ультразвуковое исследование / Ultrasound examination

Все УЗИ, включая измерения в 2D- и 3D-режимах, а также соноэластографию выполняли с использованием УЗ-сканера W10 (Samsung Medison, Республика Корея). Сканирование проводилось с применением внутриполостного объемного датчика EV2-10A (частота 2–10 МГц) в режиме реального времени. Методика выполнения эластографии шейки матки представлена в ранее опубликованной работе [9].

Методика выполнения эластографии основывалась на протоколе исследования CELASTO и рекомендациях Фонда фетальной медицины (англ. Fetal Medicine Foundation, FMF). После получения сагиттального сечения шейки матки в В-режиме проводилась автоматическая эластография E-Cervix. Изображения фиксировались при условии стабильных индикаторов надежности (зеленые полосы движения). Область интереса (англ. region of interest, ROI) формировалась по линии цервикального канала с включением всей ткани шейки. Получали не менее 3 измерений, для анализа отбирали изображения, соответствующие критериям качества полученных изображений. Кластерный анализ проводился на основании 5 параметров E-Cervix [10]: коэффициента жесткости (англ. hardness ratio, HR), индекса контрастности эластичности (англ. elasticity contrast index, ECI), деформации внутреннего зева (англ. internal os strain, IOS), деформации наружного зева (англ. external os strain, EOS), а также длины шейки матки (англ. cervical length, CL).

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программ Jamovi (версия 2.4.8, Австралия), IBM SPSS Statistics (версия 27.0, IBM Corp., США) и GraphPad Prism (версия 10.0, GraphPad Software, США). Тип распределения количественных показателей оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Показатели с нормальным распределением представлены как среднее и стандартное отклонение (M ± SD), а с ненормальным – как медиана и межквартильный размах (Me [Q₁; Q₃]). Для сравнения независимых групп применяли U-критерий Манна–Уитни при сравнении двух групп и критерий Краскела–Уоллиса с применением апостериорного анализа (пост-хок анализ) Данна–­Стила–­Кричлоу–Флигнера (Dwass–Steel–Critchlow–Fligner, DSCF) при сравнении трех и более групп. Категориальные переменные анализировали с использованием критерия χ² Пирсона или точного критерия Фишера. Связь между количественными показателями оценивали методом ранговой корреляции Спирмена (англ. Spearman rank correlation coefficient, ρ).

Результаты / Results

Анамнестическая характеристика / Anamnestic characteristics

Срок гестации на момент получения клинического материала статистически значимо различался между фенотипическими группами (p < 0,001) и составил 36,00 ± 1,52 недель в группе с фенотипом 1, 37,29 ± 2,07 недель в группе с фенотипом 2 и 38,57 ± 1,40 недель в группе с фенотипом 3. Парный анализ выявил значимые различия между фенотипами 1 и 2 (p = 0,018), 1 и 3 (p < 0,001), а также между фенотипами 2 и 3 (p = 0,012).

Интервал от момента обследования до родоразрешения также существенно различался между группами (p < 0,001): медиана составила 20,00 [ 15,00; 23,00] суток при фенотипе 1, 9,00 [ 6,00; 12,50] суток при фенотипе 2 и 2,00 [ 2,00; 3,75] суток при фенотипе 3 (p < 0,001).

Пациентки были сопоставимы по основным демографическим и антропометрическим показателям. Статистически значимых различий по возрасту, индексу массы тела, росту и массе тела между группами с разными фенотипами не выявлено. Паритет беременности и родов также не различался между группами. Частота гинекологической, соматической патологии и осложнений текущей беременности между группами не различалась. Исходы беременности не зависели от фенотипа зрелости шейки матки, статистически значимых межгрупповых различий не выявлено (p > 0,05).

Микробиологическая характеристика фенотипов шейки матки / Microbiological characteristics of cervical phenotypes

Состав микробиоты не демонстрировал фенотип-специфических различий, что свидетельствует об отсутствии четкой микробиологической стратификации фенотипов зрелости шейки матки. На рисунке 2 представлены частоты выявления микроорганизмов (%) в различных фенотипах ремоделирования шейки матки. Наличие микроорганизма кодировалось как «1», отсутствие – как «0», после чего рассчитывалась доля положительных результатов в каждой группе.

Анализ клинико-анамнестических факторов выявил отдельные статистически значимые ассоциации: у пациенток с бактериальным вагинозом в анамнезе отмечалось увеличение представленности комплекса облигатных анаэробов Sneathia / Leptotrichia / Fusobacterium (t = 2,191; p = 0,031). Наличие инфекции мочевых путей в анамнезе ассоциировалось с более высокой частотой выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae (t = –2,644; p = 0,010). Концентрация Lactobacillus spp. положительно коррелировала с длиной шейки матки (ρ = 0,411; p < 0,001) и жесткостью шейки матки (HR) (ρ = 0,419; p < 0,001) и была ниже у пациенток с инфекциями мочевыводящих путей в анамнезе (t = –2,1; p = 0,039).

Был выявлен ряд микроорганизмов, отрицательно коррелирующих с длиной шейки матки: Streptococcus (ρ = –0,235; p = 0,033), Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas (ρ = –0,265; p = 0,016), Sneathia / Leptotrichia / Fusobacterium (ρ = –0,251; p = 0,023), Megasphaera / Veillonella / Dialister (ρ = –0,233; p = 0,035), Peptostreptococcus (ρ = –0,267; p = 0,015), Atopobium vaginae (ρ = –0,319; p = 0,004) и Mobiluncus / Corynebacterium (ρ = –0,221; p = 0,046).

Жесткость шейки матки (HR) продемонстрировала еще более выраженные и системные отрицательные корреляции с микробиотой цервикального канала. Значимые связи были выявлены для Enterobacteriaceae (ρ = –0,231; p = 0,037), Streptococcus (ρ = –0,251; p = 0,023), Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas (ρ = –0,247; p = 0,026), Eubacterium (ρ = –0,285; p = 0,009), Sneathia / Leptotrichia / Fusobacterium (ρ = –0,277; p = 0,012), Megasphaera / Veillonella / Dialister (ρ = –0,359; p < 0,001), Peptostreptococcus (ρ = –0,284; p = 0,010), Atopobium vaginae (ρ = –0,395; p < 0,001) и Mobiluncus / Corynebacterium (ρ = –0,282; p = 0,010).

Таким образом, сравнительный анализ не установил статистически значимых различий таксономического состава микробиоты цервикального канала между фенотипами зрелости шейки матки (p > 0,05), что указывает на отсутствие фенотип-специфического распределения микроорганизмов. Вместе с тем показано, что увеличение представленности условно-патогенных микроорганизмов коррелировало со снижением жесткости шейки матки (HR) и уменьшением ее длины (CL). Полученные данные свидетельствуют о том, что микробиота цервикального канала не определяет фенотип зрелости как дискретное состояние, а вероятно выступает модулятором степени цервикального ремоделирования, внося вклад в процессы биомеханической перестройки шейки матки.

Иммунологическая характеристика фенотипов шейки матки / Immunological characteristics of cervical phenotypes

Для оценки роли локального иммунного статуса в процессах цервикального ремоделирования выполнено исследование экспрессии мРНК воспалительных и иммунорегуляторных маркеров в цервикальном канале (табл. 1).

Укорочение шейки матки сопровождалось снижением уровней IL-18 и GATA3 (ρ = 0,240–0,355; p < 0,05). Уменьшение жесткости шейки матки (HR) также ассоциировалось с более низкой экспрессией GATA3 и CD68 (ρ = 0,271–0,294; p < 0,05). Анализ взаимосвязи иммунных показателей с состоянием цервикального микробиоценоза выявил слабые ассоциации индекса воспаления с представителями условно-патогенной микрофлоры: отмечены умеренные положительные корреляции индекса воспаления с относительным содержанием Enterobacteriaceae (ρ = 0,236; p = 0,035) и Staphylococcus (ρ = 0,228; p = 0,042). По результатам анализа установлено, что значения индекса воспаления статистически значимо не различались между фенотипами (p > 0,05).

Анализ корреляций между маркерами локального иммунитета и составом микробиоты цервикального канала выявил преимущественно отрицательные ассоциации воспалительных показателей (IL-18, GATA3, CD68, TNF-α) с представителями микрофлоры (Gardnerella, Lachnobacterium/Clostridium, Mobiluncus, Peptostreptococcus). Наиболее выраженные ассоциации отмечены для IL-18, демонстрировавшего множественные умеренные и сильные отрицательные корреляции (ρ до –0,45). Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение условно-патогенных микроорганизмов цервикального канала сопровождается не усилением, а снижением локальной иммунной активности (табл. 2).

Корреляционный анализ продемонстрировал, что длина шейки матки (СL) статистически значимо положительно ассоциировала с экспрессией IL-18 и GATA3 (ρ = 0,24–0,36; p < 0,05), тогда как показатель жесткости шейки матки (HR) демонстрировал положительные корреляции с GATA3 и CD68 (ρ = 0,27–0,29; p < 0,05) (рис. 3). При стратификации по фенотипам зрелости установлено, что максимальные уровни IL-18, GATA3 и CD68 наблюдались у пациенток с «незрелым» фенотипом и последовательно снижались при переходе к «созревающему» и «зрелому» фенотипам (p < 0,05).

Выявленная динамика указывает на то, что иммуновоспалительный компонент является ранним событием цервикального ремоделирования и возможно предшествует структурной перестройке внеклеточного матрикса и снижению механической прочности ткани. Отсутствие параллельного увеличения бактериальной нагрузки и отсутствие положительных ассоциаций между микробиотой и экспрессией цитокинов позволяют рассматривать данные изменения не как проявление инфекционного воспаления, а как асептическое (стерильное) воспаление. Следовательно, IL-18, GATA3 и CD68 могут рассматриваться как ключевые компоненты локального иммунного ответа, участвующие как в инфекционно-обусловленных, так и в асептических механизмах воспаления.

Обсуждение / Discussion

Проведенное исследование позволило комплексно оценить взаимосвязь биомеханических, иммунных, гормонально-матричных и микробиологических факторов, участвующих в формировании фенотипов зрелости шейки матки. Совокупность полученных клинико-лабораторных, инструментальных и статистических данных свидетельствует о том, что одним из факторов цервикального созревания шейки матки является воспаление.

Анализ микробиоценоза показал отсутствие фенотип-специфических различий таксономического состава микробиоты цервикального канала, несмотря на выявленные количественные изменения ОБМ и абсолютной концентрации Lactobacillus spp. Это свидетельствует о том, что микробиота не формирует самостоятельные фенотипы зрелости шейки матки. Вместе с тем выявлены устойчивые связи между количественными характеристиками микробиоценоза и биомеханическими параметрами шейки матки: увеличение доли анаэробных и условно-патогенных микроорганизмов сопровождалось уменьшением длины и снижением жесткости шейки матки, тогда как более высокая представленность Lactobacillus spp. ассоциировалась с большей структурной стабильностью ткани шейки матки. Вероятно, микробиота выступает не детерминантом, а модифицирующим фактором, влияющим на интенсивность ремоделирования соединительной ткани. Подобные данные согласуются с результатами S. Lu с соавт. (2024), показавших отсутствие значимых различий микробного разнообразия при различной степени зрелости шейки матки [8].

Одним из ключевых наблюдений стало последовательное снижение экспрессии локальных иммунных маркеров IL-18, GATA3 и CD68 по мере созревания шейки матки. Полученная динамика указывает, что иммунный компонент наиболее выражен на ранних этапах ремоделирования и уменьшается по мере структурной перестройки ткани.

Полученные результаты согласуются с данными О.В. Будиловской с соавт. (2021), показавшей, что при бактериальном вагинозе снижается экспрессия IL-18 и GATA3, тогда как доминирование Lactobacillus crispatus ассоциировано с более высокими уровнями IL-18, GATA3 и CD68. Более высокая концентрация Lactobacillus spp. ассоциировалась с большей длиной и жесткостью шейки матки и более высокой экспрессией IL-18, GATA3 и CD68, тогда как увеличение доли облигатных анаэробов и условно-патогенной микробиоты сопровождалось снижением их экспрессии [11].

Полученные данные подтверждают концепцию воспаления как одного из ключевых механизмов цервикального ремоделирования. Полученные данные согласуются с современными представлениями о том, что физиологическое созревание шейки матки сопровождается контролируемой активацией врожденного иммунитета без выраженного инфекционного компонента. Подобный механизм описан в работах S.M. Yellon [12], K.M. Myers с соавт. [13], M.L. Akins [14] с соавт., демонстрирующих участие макрофагов, нейтрофилов и матриксных металлопротеиназ в перестройке цервикального матрикса.

Ограничения исследования / Study limitations

К ограничениям исследования следует отнести одноцентровый дизайн и относительно небольшой объем выборки, а также анализ иммунных маркеров на уровне мРНК, что не всегда полностью отражает уровень синтеза соответствующих белков. Полученные результаты требуют подтверждения в многоцентровых исследованиях с учетом срока гестации и динамического наблюдения, что позволит уточнить вклад иммунных, гормональных и микробиологических факторов в формирование фенотипов зрелости шейки матки и риск преждевременного родоразрешения. Следует учитывать, что фенотипы зрелости частично отражают гестационную динамику процессов ремоделирования. Однако выявленные ассоциации иммунных и биохимических маркеров с параметрами эластографии свидетельствуют о том, что активация каскада ремоделирования может происходить независимо от гестационного срока и отражает индивидуальные темпы биологического созревания шейки матки.

Заключение / Conclusion

Фенотипы зрелости шейки матки, выделенные на основании параметров цервикометрии и эластографии E-Cervix, ассоциированы с различиями локального иммунного статуса и количественными характеристиками микробиоценоза цервикального канала. По мере перехода от незрелого к зрелому фенотипу отмечается снижение экспрессии IL-18, GATA3 и CD68, что может отражать перестройку локального иммунного микроокружения в процессе цервикального ремоделирования. Микробиота цервикального канала не формирует самостоятельные фенотипы зрелости шейки матки, однако увеличение представленности анаэробных и условно-патогенных микроорганизмов коррелировало с уменьшением длины шейки матки и снижением ее жесткости. Полученные данные подтверждают целесообразность интегративной оценки ультразвуковых, иммунных и микробиологических маркеров для характеристики биологических этапов цервикального ремоделирования.