Комплексный биохимический анализ состава препаратов и биологически активных добавок омега-3 полиненасыщенных жирных кислот для нутрициальной поддержки беременности

Введение / Introduction

Длинноцепочечные омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ω3-ПНЖК) абсолютно незаменимы для нормального функционирования репродукции, физиологического течения беременности, развития зрения, мозга плода, формирования иммунного ответа [1][2]. Омега-3 ПНЖК тормозят старение и фиброзирование тканей почек и печени [3], миокарда [4], зрения и мозга [5], кожи [6]. Важность обеспеченности организма ω3-ПНЖК следует из фундаментальной биохимии, детально описанной в многочисленных оригинальных исследованиях, обзорных статьях, доказательных исследованиях и экспертных консенсусах [7][8].

В частности, из таких ключевых форм ω3-ПНЖК, как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и докозагексаеновая кислота (ДГК), образуются важнейшие медиаторы воспаления – эйкозаноиды и докозаноиды, приниципально важные для физиологического окончания воспаления (англ. resolution of inflammation), для нейропротекции и для нормофизиологического роста тканей плода, для нутрициальной поддержки беременности и профилактики послеродовой депрессии [1].

ЭПК и ДГК, активируя рецептор, активируемый пролифератором пероксисом альфа (англ. рeroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα) и другие сигнальные пути, способствуют улучшению энергетического метаболизма в печени, увеличивая β-окисление жирных кислот и продукцию АТФ [3], ингибируют синтез провоспалительных медиаторов, обеспечивают поддержку барьерной функции и гидратации кожи [6][9], способствуют синтезу антифибротических метаболитов, защищающих ткань почек при токсикозе, препятствуя формированию хронической болезни почек [10].

Благотворное влияние ω3-ПНЖК на репродуктивные процессы у женщин основано не только на поддержке соматического здоровья, но и прямой поддержке репродуктивной системы. Достаточная обеспеченность ЭПК и ДГК способствует формированию и предотвращает старение ооцитов, тормозя ферроптоз [11], поддерживая уровень лютеинизирующего гормона и соотношение прогестерон/эстрадиол [12].

Важным аспектом действия ω3-ПНЖК является тонкая модуляция биосинтеза простагландинов (англ. prostaglandin, PG) и, в частности, PGE2 и PGF2α. Эти 2 простагландина регулируют синтез прогестерона, состояние желтого тела и лютеолиз, сократительную функцию матки при родовой деятельности, участвующих в созревании шейки матки, разрыве плодных оболочек, сокращении миометрия и воспалении. Поскольку существует множество подтипов рецепторов для PGE2 и PGF2α, связанных с различными сигнальными путями, эффекты PGE2 и PGF2α в значительной степени зависят от пространственной и временной экспрессии этих рецепторов во внутриматочных тканях. PGE2, вероятно, более важен для начала родов, в то время как PGF2α может играть более важную роль в их завершении, что может быть связано с дифференциальным действием PGE2 и PGF2α в тканях матки [13].

Однако избыточная активность PGE2 и PGF2α, стимулируя приток нейтрофилов и продукцию цитокинов, экспрессию циклооксигеназы-2 (тем самым усиливая свою собственную продукцию), отрицательно сказывается на продолжительности вынашивания. Соотношение с ω3:ω6 ПНЖК в диете влияет на синтез PGE2 и PGF2α. Например, в эксперименте у мышей, получавших ω3-ПНЖК, все показатели фертильности были в норме, лютеолиз и роды также прошли нормально, а уровни синтеза PGF2α и PGE2 в матке составляли 50 % по сравнению с группой ω6-ПНЖК мышей, получавших соевое масло, что способствовало поддержке нормальной продолжительности вынашивания [14]. Употребление в пищу ω3-ПНЖК может продлевать беременность за счет снижения внутриматочной выработки PGE2 и PGF2α [15], что подтверждено в доказательных исследованиях [1][8].

Принимая во внимание крайне низкую обеспеченность россиянок ω3-ПНЖК [1], необходимо использование препаратов ω3-ПНЖК для компенсации этого микронутриентного дефицита. Очевидно, что пользу от применения препаратов ω3-ПНЖК можно ожидать только при условии применения качественных ω3-ПНЖК, действительно содержащих надлежащее количество ω3-ПНЖК и не содержащих примесей с прооксидантным и атерогенным действием [16].

Содержание в составе экстрактов ω3-ПНЖК, с одной стороны, ЭПК и ДГК, и, с другой стороны, других жирных кислот (как ненасыщенных, так и насыщенных) оказывает существенное влияние на фармакологические свойства соответствующих препаратов и биологически активных добавок (БАД). Например, насыщенные пальмитиновая, миристиновая, лауриновая кислоты стимулируют атерогенез как через повышение содержания общего холестерина и липопротеинов низкой плотности, так и через активацию провоспалительных толл-подобных рецепторов (англ. toll-like receptors, TLR) TLR4 и цитокинов – интерлейкина (англ. interleukin, IL) IL-6 и фактора некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) [17][18]. Стеариновая и пальмитиновая кислоты способствуют развитию инсулинорезистентности [1]. Ненасыщенные ω-6 и ω-11 жирные кислоты также могут провоцировать развитие провоспалительных реакций. Поэтому стандартизация состава экстрактов ω3-ПНЖК по различным видам жирных кислот – фундаментальная основа эффективности и безопасности соответствующих препаратов и БАД на основе ω3-ПНЖК [16].

В настоящей работе мы представляем результаты количественного хроматографического анализа 10 препаратов ω-3 ПНЖК. Собранные биохимические данные анализировались с использованием современного комплекса информационных технологий, развиваемых в рамках топологического подхода к анализу данных [19–21].

Цель: сравнить образцы ω3-ПНЖК по степени стандартизации состава по эйкозапентаеновой ω3-ПНЖК и докозагексаеновой ω3-ПНЖК, оценить степень очистки от жирнокислотных примесей.

Материалы и методы / Materials and Methods

Препараты, исследованные в настоящей работе, перечислены в таблице 1. Большинство исследованных препаратов изготовлялись на основе сырья, включающего жир тех или иных сортов рыбы.

Хроматографическое определение жирнокислотного состава / Chromatographically determined fatty acid composition

Образцы препаратов из таблицы 1 растворяли в гексане и подвергали солянокислому гидролизу в присутствии метанола (Methanolic-HCl (3N) Supelco) в плотно укупоренных виалах при 90 °С в течение 1 часа. Полученные таким образом метиловые эфиры жирных кислот анализировали на хроматографе GCMS-QP2010 Ultra (Shimadsu, Япония) при следующих условиях: газ-носитель – гелий, линейная скорость 35,6 см/сек (0,9 мл/мин), деление потока 4:1. Колонка капиллярная MDN-5 (Supelco), длина 30 метров, внутренний диметр 0,25 мм. Параметры хроматографа: в режиме градиента температур, детектор 200 °С, интерфейс 205 °С, режим измерения – от 45 до 450 m/z. Качественный состав полученных смесей определяли с использованием библиотеки масс-спектров NIST 11 (National Institute of Standards and Technology 11), количественный – конкретными соединениями из перечисленных в таблице 2. В результате проведения настоящей серии экспериментов каждый препарат описывался вектором из 55 позиций, в каждой из которых представлена площадь пика, соответствующая тому или иному соединению из таблицы 2.

Для характеристики состава каждого из исследованных препаратов ω3-ПНЖК использовался профиль, включающий все 55 соединений, перечисленных в таблице 2. Помимо отдельных соединений, на основе уровней отдельных соединений и их химических типов (перечислены в крайней правой колонке таблицы 2) для характеризации каждого из исследованных образцов были рассчитаны суммарные характеристики жирнокислотного состава: общее содержание ω3, ω6, ω7, ω9, ω11-ПНЖК, ЭПК, ДГК, ЭПК+ДГК, других ω3 (Др.ω3), насыщенных жирных кислот (НЖК).

Как и в работе [15], мы также использовали «коэффициент стандартизации» (КСТ), оценивающий соответствие реально измеренных уровней ω3-ПНЖК содержанию ω3-ПНЖК, заявляемому производителем. КСТ рассчитывается как композиция 4 компонентов:

КСТ (%) = 1 – ω3_соотв – ЭПК_соотв – ДГК_соотв – Др.ω3_соотв, где

• ω3_соотв = ω3_заявл (%) – ω3_изм (%) – соответствие заявленного общего содержания ω3-ПНЖК измеренному; если препарат содержит больше ω3, чем заявлено, то это увеличивает ω3_соотв;
• ЭПК_соотв = ЭПК_заявл (%) – ЭПК_изм (%), если заявлено содержание ЭПК; если нет, то назначается «штрафной процент» (мы использовали величину в 15 %, которая отражает среднее содержание ЭПК в слабо стандартизированных препаратах);
• ДГК_соотв = ДГК_заявл (%) – ДГК_изм (%), если заявлено содержание ДГК, в противном случае – «штрафной процент» (10 %);
• Др.ω3_соотв = |Др.ω3_заявл – Др.ω3_изм| – абсолютное значение разности между заявленным измеренным содержанием других ω3-ПНЖК, которое определяется как разница между общим содержанием ω3 и суммарным содержанием ЭПК+ДГК.

Статистический анализ / Statistical analysis

Для стандартной обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия χ², T-критерий Вилкоксона–Манна–Уитни и тест Стьюдента в электронных таблицах Microsoft Excel. Помимо стандартных методов статистики, в ходе анализа данных скрининга были использованы новые математические подходы к интеллектуальному анализу данных, основанные на методе метрических сгущений [15].

Результаты / Results

В результате проведения экспериментов были получены хроматограммы для каждого из 10 препаратов. Пики идентифицировались по библиотеке масс спектров NIST 11; пример расшифровки приведен на рисунке 1 (образец препарата с высокой степенью стандартизации Фемибион Наталкер-2 – № 7 в таблице 1).

В таблице 3 приведены результаты – суммарные характеристики жирнокислотного состава (общее содержание ω3, ω6, ПНЖК, НЖК и др.), вычисленные на основе 55-компонентных профилей жирнокислотного состава. Визуальный анализ данных в таблице 3 указывает на существование экстрактов с очень высоким суммарным содержанием ω3-ПНЖК в форме ЭПК и/или ДГК. Например, содержание ω3-ПНЖК в среднем по всем исследованным препаратам составило 58,2 ± 27,2 % (ЭПК+ДГК = 50,1 ± 26,5 %). Если расположить строки таблицы 3 по возрастанию общего содержания ω3-ПНЖК, то становится очевидным наличие экстрактов с более низким общим содержанием ω3-ПНЖК (Омеганол – 12,59 %, Омегамама – 34,26 % и др.) и экстрактов с весьма высоким содержанием ω3-ПНЖК: Омакор – 97 % ω3-ПНЖК (ЭПК+ДГК = 91,3 %), Фемибион Наталкер-2 – 75 % ω3-ПНЖК (ЭПК+ДГК = 60 %) и др.

Изученные суммарные характеристики жирнокислотного состава в существенной степени коррелируют друг с другом. Корреляционный анализ между заявленными и измеренными показателями жирнокислотного состава (рис. 2) показал высоко достоверные и выраженные прямые корреляции (положительные значения коэффициента корреляции r) между заявленным и измеренным процентным содержанием ЭПК (r = 0,91), ДГК (r = 0,87), ЭПК+ДГК (r = 0,87) и общим количеством ω3-ПНЖК (r = 0,90). Таким образом, в целом по выборке заявляемые производителями показатели содержания ω3-ПНЖК соответствуют полученным результатам.

При оценке препаратов ω3-ПНЖК с точки зрения нутрициальной поддержки той или иной группы пациентов важно оценить относительное содержание ЭПК и ДГК. Например, для кардиопротекции наибольший интерес представляет именно ЭПК и ее производные (этиловые, бутиловые эфиры). В то же время для нутрициальной поддержки беременности и для нормофизиологического развития центральной нервной системы плода (и, впоследствии, ребенка) важно относительное содержание в препарате ДГК (так как именно депо ДГК истощается в мембранах эритроцитов, которые усиленно переносят ДГК к плоду) [22]. Среди исследованных препаратов наиболее высоким относительным содержанием ДГК отличались именно препараты ω3-ПНЖК, предназначенные для беременных (Фемибион Наталкер-2 и др., рис. 3).

Для оценки качества препаратов ω3-ПНЖК в целом и для нахождения сходств и отличий между исследованными образцами препаратов необходимо использовать все показатели профиля жирнокислотного состава. В результате проведения хроматографического анализа каждый препарат был представлен вектором из 55 позиций, соответствующих веществам в таблице 2. В рамках фармакоинформационного профилирования данные по составу исследуемых препаратов были спроецированы на плоскую диаграмму, отражающую расстояния между всеми исследованными парами препаратов. С использованием метрики Колмогорова–Смирнова в приложении к этим 55-мерным векторам мы рассчитали «расстояния» между препаратами, исследовали наличие кластеров и представили полученные результаты на метрической карте (рис. 4). Диаграмма получена посредством проецирования 55-мерных векторов для каждого соединения на плоскость. Чем больше расстояние между точками, тем больше различия в фармакоинформационных профилях соответствующих соединений. Оси X и Y отражают (в у.е.) некоторые «главные компоненты» состава, которые расшифровываются далее в тексте настоящей статьи. Методом анализа метрических сгущений установлено наличие двух кластеров.

На полученной метрической диаграмме (рис. 4) каждому препарату соответствует одна точка. Горизонтальная ось координат соответствует оценке примесного состава препаратов, вертикальная – содержанию ω3-ПНЖК. Из рисунка 4 очевидно существование двух четко отделяемых кластеров более стандартизированных и менее стандартизированных препаратов ω3-ПНЖК.

Полученные при построении метрической карты на рисунке 4 «условные оси» X и Y должны быть расшифрованы, т. е. сопоставлены содержанию каких-то конкретных веществ. Для установления конкретных показателей биохимического качества стандартизации мы сравнили содержание всех 55 веществ в кластере более стандартизированных препаратов с содержанием этих веществ в кластере менее стандартизированных препаратов. Выявленные достоверные различия приведены в таблице 4.

В результате проведенного анализа данных было получено несколько вариантов расшифровки осей X, Y диаграммы на рисунке 4. Эти варианты расшифровки представляют собой различные наиболее информативные маркеры жирнокислотного состава, позволяющие максимально точно отличать более стандартизированные препараты ω3-ПНЖК от менее стандартизированных (рис. 5).

В качестве наиболее информативных маркеров жирнокислотного состава были выбраны 1) маркеры "sum+", "sum–" («sum+» – сумма площадей пиков c “+” в колонке «+/–» таблицы 4, маркер «sum–» – сумма площадей пиков с “–” в колонке «+/–» таблицы 4); 2) общие содержания ω11 или ω7+ω9+ω11; 3) ЭПК+ДГК и общее содержание ω3-ПНЖК.

Приведенные на рисунке 5 диаграммы состава исследованных препаратов в этих координатах наглядно иллюстрируют перечисленные варианты выбора маркеров. При использовании пары маркеров "sum–" и "sum+" кластер стандартизированных препаратов отделяется от кластера нестандартизированных критериями «sum+ > 15 %», «sum– < 12 %». При использовании координат «ω11», «sum+» критерии «ω11 < 0,2 %», «sum+ > 15 %», а при «ω7+ω9+ω11», «ω3» кластеры разделяются критериями «ω7+ω9+ω11 < 22 %», «ω3 > 70 %» (хотя расстояние между кластерами достаточно мало). Хорошее разделение кластеров по обеим координатам очевидно при использовании пары координат («ω11», «ЭПК+ДГК»). В данном случае кластеры разделимы вертикальными линиям и находятся на существенном расстоянии друг от друга, что позволяет сформулировать критерии разделения кластеров: «ω11 < 0,2 %», «ЭПК+ДГК > 57 %».

Следует отметить, что в кластере более стандартизированных препаратов присутствуют не только лекарственный препарат Омакор, но и микронутриентные комплексы, зарегистрированные как «нутриентные биологически активные добавки» (Фемибион Наталкер-2, Солгар омега-3 950 мг и др.). Несмотря на указанное формальное различие в регистрации препарата, содержание ЭПК+ДГК достаточно высоко (более 75 %), а содержание самых нежелательных примесей (НЖК) не превышает 4 %.

В дополнение к маркерам «ЭПК+ДГК» и «ω11», позволяющим классифицировать препараты ω3-ПНЖК как более стандартизированные и менее стандартизированные, мы использовали коэффициент стандартизации (КСТ, %); примеры расчета КСТ (%) были приведены в таблице 4. Значение КСТ (%) позволяет однозначно выделить препараты, в которых содержится больше полезной фракции ПНЖК, чем заявлено производителем. Наибольшими значениям КСТ отличались Фемибион Наталкер-2 и Омегатрин (рис. 6).

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что, к сожалению, среди врачей все еще встречается терминологическая путаница, при которой все препараты ω3-ПНЖК называются с использованием такого термина 300–500-летней давности, как «рыбий жир» [7]. Данный термин весьма условен и не соответствует реалиям современной фармакологии ω3-ПНЖК.

Во-первых, препараты, содержащие ω3-ПНЖК, могут изготовляться вообще без использования экстрактов жира рыб (с использованием, например, экстрактов жира морских млекопитающих, экстрактов водорослей, синтетических форм ω3-ПНЖК и др.).

Во-вторых, само использование термина «жир» не совсем грамотно биохимически, так как жирами называются сложные эфиры жирных кислот с глицерином. При реальном приготовлении препаратов ω3-ПНЖК из экстрактов жира рыб зачастую проводится частичное омыление жиров исходного экстракта с удалением глицерина и с последующей этерификацией полученной смеси жирных кислот метиловым, этиловым и другими короткоцепочеными одноатомными спиртами. Полученная таким образом смесь никоим образом не является «жиром» в научном значении этого слова.

В-третьих, и самое главное, препараты ω3-ПНЖК, из какой бы природной субстанции они ни приготовлялись, могут проходить существенную стандартизацию по составу (например, Омакор, Фемибион Наталкер-2 и другие препараты из кластера 1 на рисунке 4).

Полученные нами критерии качества препаратов ω3-ПНЖК позволяют количественно уточнить такие неадекватные термины как «рыбий жир» и проводить своего рода «скрининговую» оценку качества стандартизации таких препаратов.

Заключение / Conclusion

Эффективность препаратов ω3-ПНЖК для беременных в существенной мере зависит от стандартизации содержания экстрактов ω3-ПНЖК по ЭПК, ДГК и по другим видам жирных кислот. В настоящей работе мы провели комплексное исследование состава 10 препаратов ω3-ПНЖК с хроматографическим определением 55 метаболитов жирных кислот и других соединений. Предложены эффективные критерии оценки качества жирнокислотного состава препаратов ω3-ПНЖК.

Выявлены препараты с высокой степенью стандартизации по ω3-ПНЖК (Омакор, Фемибион Наталкер-2 и др.). Однако препарат Омакор фактически не рекомендуется для беременных (см. инструкцию: «Назначать Омакор беременным следует с осторожностью, только после тщательной оценки соотношения риска и пользы… Препарат не должен применяться в период грудного вскармливания»). Такого ограничения не имеется в случае Фемибион Наталкер-2, который предназначен для употребления беременными и в период лактации. Поддержка беременных посредством стандартизированных препаратов ω3-ПНЖК способствует нормальной продолжительности беременности, профилактирует послеродовую депрессию и улучшает развитие зрения, мозга плода, снижает риск аллергических заболеваний новорожденого.