Внеклеточные везикулы в диагностике и прогнозировании злокачественных новообразований женской репродуктивной системы: современные данные и перспективы

Введение / Introduction

Злокачественные новообразования (ЗНО) органов женской репродуктивной системы, в частности, рак шейки матки (РШМ), рак эндометрия (РЭ) и рак яичников (РЯ) остаются ведущими причинами онкологической заболеваемости и смертности среди женщин в России и в мире [1][2]. За последнее десятилетие в РФ наблюдается рост заболеваемости: РЭ – на 35 %, РЯ – на 24,7 %, РШМ – на 12,6 %. Особенно тревожна тенденция к «омоложению» патологии – увеличению частоты выявления опухолей у женщин в возрасте 21–36 лет [3–5].

На этом фоне особое внимание привлекают внеклеточные везикулы (ВВ) – микроструктуры, включающие экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца. Они играют ключевую роль в межклеточной коммуникации и переносят биологически активные молекулы – микроРНК (miR), длинные некодирующие РНК (англ. long non-coding RNAs, lncRNAs), белки, липиды и фрагменты ДНК [6–9]. Благодаря высокой стабильности в биологических жидкостях и специфичности к клеткам происхождения, ВВ рассматриваются как ценные носители диагностической и прогностической информации.

В гинекологической онкологии ВВ исследуются в качестве неинвазивных биомаркеров, средств мониторинга лечения и систем доставки противоопухолевых препаратов. Однако, несмотря на обнадеживающие результаты доклинических и первых клинических исследований, требуется стандартизация методов выделения ВВ, унификация аналитических подходов и проведение крупных мультицентровых исследований. В настоящем обзоре на основании данных литературы (доклинические и клинические исследования) анализируется роль ВВ в патофизиологии, диагностике и прогнозировании течения РШМ, РЭ и РЯ.

Внеклеточные везикулы при раке шейки матки / Extracellular vesicles in cervical cancer

Диагностика / Diagnostics

Одним из приоритетных направлений в поиске неинвазивных диагностических решений при РШМ является исследование ВВ, содержащих молекулы некодирующей РНК, такие как микроРНК (miR) и lncRNA. В рамках одного из клинических исследований, включавшего секвенирование экзосомальных микроРНК (англ. exosomal microRNA, exomiR) в образцах плазмы у женщин с РШМ, цервикальной интраэпителиальной неоплазией (англ. cervical intraepithelial neoplasia, CIN) и у здоровых добровольцев, была выявлена диагностически значимая панель из 8 miR: let-7a-3p, let-7d-3p, miR-30d-5p, miR-144-5p, miR-182-5p, miR-183-5p, miR-215-5p и miR-4443. Эти молекулы позволяли с высокой точностью дифференцировать CIN II+ от CIN I и нормального эпителия, при этом значение площади под кривой (англ. area under curve, AUC) ROC-анализа составило 0,992 [10]. Пути, связанные с функцией указанных miR, включали ключевые сигнальные каскады, контролирующие онкогенез. Особенно информативной оказалась комбинация let-7d-3p и miR-30d-5p, обеспечившая диагностическую точность с AUC = 0,828 при разграничении CIN II+ и менее выраженных патологий.

Также установлено, что miR-125a-5p, обладающая способностью индуцировать апоптоз через активацию сигнального пути p53 [11] и ингибировать пролиферативную и метастатическую активность опухолевых клеток [12], обнаруживается в существенно меньших количествах в экзосомах, выделенных из плазмы пациенток с РШМ, по сравнению с контрольной группой [13]. Напротив, уровни miR-21 и miR-146a, известных активаторов клеточной пролиферации [14][15], повышены в цервиковагинальных ВВ пациенток с РШМ по сравнению как с ВПЧ-инфицированными, так и с ВПЧ-негативными здоровыми женщинами [16]. Эти данные свидетельствуют о возможной роли вирусной инфекции в инициации патологической экспрессии микроРНК.

Особый интерес также представляет экспрессия lncRNAs, включая HOTAIR (англ. HOX transcript antisense intergenic RNA; транскрипт антисенс-РНК в межгенном регионе комплекса HOX), MALAT1 (англ. metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1; транскрипт, ассоциированный с метастазами при аденокарциноме легких) и MEG3 (англ. maternally expressed gene 3; ген, экспрессируемый по материнской линииv3), которая значимо варьировала в экзосомах цервиковагинального лаважа женщин с РШМ в сравнении с контрольной группой без онкологической патологии [17]. Различия в экспрессии указанных lncRNAs также выявлены между ВПЧ-позитивными и ВПЧ-негативными контрольными субъектами, что подтверждает их связь с патогенезом РШМ [17]. Эти РНК ранее демонстрировали участие в пролиферации, инвазии и метастазировании опухолевых клеток шейки матки, а также коррелировали с клинико-прогностическими характеристиками заболевания [18–20].

Среди белковых компонентов ВВ наиболее изученным является Wnt2B (англ. wingless-type MMTV integration site family, member 2B) – элемент сигнального каскада Wnt (англ. wingless-type MMTV integration site family), играющий важную роль в ремоделировании опухолевой микросреды. В пилотном исследовании сравнение уровней экзосомального и растворимого Wnt2B в сыворотке 8 пациенток с РМЖ со стадиями опухолевого процесса по классификации Международной федерации акушеров и гинекологов (англ. International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) FIGO I–II и у 4 здоровых добровольцев показало выраженное повышение его содержания в экзосомах [21]. В аналогичных условиях у больных РШМ также отмечалось значительное увеличение концентрации как экзосомального, так и неэкзосомального Wnt2B, однако экзосомальная фракция демонстрировала более чем двукратное преимущество. Кроме того, воздействие экзосом от пациенток с РШМ на фибробласты индуцировало экспрессию маркеров, ассоциированных с опухолевыми фибробластами, что подтверждает их участие в модификации микроокружения опухоли [21].

Совокупные данные подчеркивают перспективность использования ВВ в качестве биомаркеров для раннего выявления РШМ, а также для стратификации предраковых состояний (табл. 1). Тем не менее требуется дальнейшая валидация полученных результатов в многоцентровых и популяционно репрезентативных исследованиях с целью их внедрения в клиническую практику.

Прогностическая значимость / Prognostic significance

Современные исследования подтверждают высокую прогностическую ценность экзосомальных miR у пациенток с РШМ, в том числе после конкомитантной химиолучевой терапии (КХТ). В одном исследовании выявлено 9 miR с AUC > 0,68 (включая miR-148a-5p, miR-1915-3p, miR-200c-3p и др.), позволяющих надежно стратифицировать пациенток по риску рецидива. Расчетный индекс риска на основе профиля miR оказался независимым прогностическим фактором (англ. disease-specific survival, DSS) [22].

miR-221-3p, мишенью которой является VASH1 (англ. vasohibin 1; вазогибин), подавляет лимфангиогенез. Ее уровень повышен у пациенток с плоскоклеточным РШМ и лимфоузловыми метастазами, положительно коррелирует с опухолевой экспрессией и активностью лимфангиогенеза и обратно – с уровнем VASH1 [23].

miR-1468-5p и miR-142-5p участвуют в формировании иммуносупрессивной микросреды. miR-1468-5p ассоциирована с инфильтрацией PD-1+ (англ. programmed cell death protein 1; белок программируемой клеточной смерти-1) CD8+ Т-клеток и PD-L1+ (англ. programmed death-ligand 1; лиганд рецептора программируемой клеточной смерти-1) лимфоузлов, а также со снижением общей (англ. overall survival, OS) и безрецидивной (англ. disease free survival, DFS) выживаемости [24]. miR-142-5p активирует путь индоламин 2,3-диоксигеназы (англ. indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO), снижает функцию CD8+ Т-клеток и повышает соотношение кинуренин/триптофан (K:T) в сыворотке, особенно при III–IV стадиях по классификации FIGO [25].

Среди lncRNAs клинически значимыми являются DLX6-AS1 (англ. distal-lesshomeobox 6 antisense RNA 1; антисмысловая длинная некодирующая РНК, ассоциированная с геном DLX6) и EXOC7 (англ. exocyst complex component 7; компонент 7 экзоцитного комплекса). DLX6-AS1 повышена у пациенток с метастазами, низкой дифференцировкой и поздними стадиями FIGO и ассоциирована с низкой выживаемостью [26]. EXOC7 коррелирует со стадией заболевания и уровнем опухолевых маркеров – CYFRA21-1 (англ. cytokeratin fragment 21-1; цитокератиновый фрагмент 21-1), SCC (англ. squamous cell carcinoma antigen; антиген плоскоклеточной карциномы) и TPS (англ. tumor proportion score; индекс опухолевой экспрессии), а ее уровень меняется при рецидиве и лечении [27].

Белковый компонент ВВ Wnt7B (англ. wingless-type MMTV integration site family, member 7B; белок семейства Wnt7B) также ассоциирован с инвазией в строму, лимфоваскулярной инвазией и лимфогенными метастазами. Его повышение связано с ухудшением OS и DFS. Построенная номограмма на основе уровня Wnt7B демонстрирует высокую прогностическую точность [28].

Таким образом, молекулярный профиль экзосом открывает новые возможности для стратификации риска, прогноза и динамического наблюдения за пациентками с РШМ в рамках персонализированной онкогинекологии (табл. 2).

Функциональная валидация in vivo и in vitro / In vivo and in vitro functional validation

Исследования in vivo и in vitro играют ключевую роль в валидации молекул, ассоциированных с ВВ, в патогенезе РШМ. Эти модели позволяют изучить молекулярные механизмы опухолевой прогрессии, инвазии и метастазирования.

В ксенотрансплантационной мышиной модели установлено повышение транскриптов ATF1 (англ. аctivating transcription factor 1; aктивирующий транскрипционный фактор 1), DNM3 (англ. dynamin 3; динамин 3), ATF3 (англ. аctivating transcription factor 3; aктивирующий транскрипционный фактор 3), PTEN (англ. phosphatase and tensin homolog; фосфатаза и тензин-гомолог) и RAS (англ. rat sarcoma viral oncogene; онкоген вируса саркомы крыс) более чем в 5 раз по сравнению с контролем. В модели рецидива также выявлены CTSE (англ. cathepsin E; катепсин E), ZEB1 (англ. zinc finger E-box binding homeobox 1; гомеобокс 1, связывающий E-box цинковый палец), RNF85 (англ. ring finger protein 85; белок с кольцевым доменом 85) и вновь PTEN и RAS. ATF1 и RAS предложены как биомаркеры опухолевой активности в тканях и циркулирующих ВВ [29].

Экзосомы клеток C33A (англ. human cervical carcinoma cell line, HPV-negative; клеточная линия аденокарциномы шейки матки человека, ВПЧ-негативная) и SiHa (англ. human cervical squamous cell carcinoma cell line, HPV16-positive; клеточная линия плоскоклеточной карциномы шейки матки человека, ВПЧ-16-положительная) обогащены miR-221-3p, способствующей тубулированию лимфатических эндотелиальных клеток и лимфогенным метастазам in vivo [23]. Та же miR активирует ангиогенез, подавляя митоген-активируемую протеинкиназу 10 (англ. mitogen-activated protein kinase 10, MAPK10) [30].

МикроРНК miR-146a-5p, экспрессируемая в HeLa (англ. human cervical adenocarcinoma cell line, HPV18-positive, клеточная линия аденокарциномы шейки матки человека, ВПЧ-18-положительная), CaSki (англ. human cervical squamous cell carcinoma cell line, HPV16-positive, клеточная линия плоскоклеточной карциномы шейки матки человека, ВПЧ-16-положительная), SiHa и C33A, повышает инвазивность малометастатических клеток за счет инактивации пути Hippo-YAP (англ. Hippo signaling pathway/Yes-associated protein pathway; сигнальный путь Хиппо/путь белка, ассоциированного с Yes) и подавления WWC2 (англ. WW and C2 domain containing 2; белок, содержащий домены WW и C2, тип 2) [31].

Снижение miR-423-3p в HeLa, CaSki и SiHa усиливает поляризацию макрофагов по M2-фенотипу и прогрессирование опухоли. Его восстановление подавляет рост плоскоклеточного РШМ (англ. cervical squamous cell carcinoma, CSCC) [32].

МикроРНК miR-1468-5p усиливает экспрессию PD-L1 в лимфатических эндотелиальных клетках и активирует сигнальный путь Янус-киназы 2 и активатора транскрипции 3 (англ. Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 pathway, JAK2/STAT3), способствуя иммуносупрессии. Экспрессия этой miR выше в экзосомах, чем внутри клеток, особенно у опухолевых клеток [24].

Длинная некодирующая РНК (lncRNA) LINC01305, обогащенная в экзосомах C33A, усиливает злокачественную трансформацию через активацию транскрипционных факторов p65 (субъединица транскрипционного фактора NF-κB) и STAT3 (англ. signal transducer and activator of transcription 3; трансдукционный и транскрипционный активатор 3) [33][34]. TUG1 (англ. taurine upregulated gene 1), другая lncRNA, также повышенная в HeLa и CaSki по сравнению с нормальной клеточной линией CerEpiC, может участвовать в межклеточной передаче сигналов, влияющих на пролиферацию, миграцию и ангиогенез [35][36].

Еще одна lncRNA – MCM3AP-AS1 (англ. MCM3AP antisense RNA 1; антисмысловая длинная некодирующая РНК гена MCM3AP), экспрессируемая в C33A, HeLa, SiHa и особенно CaSki, влияет на опухолевый рост через регуляцию miR-93 и ингибитор циклин-зависимых киназ p21 [37].

Различия в транскриптоме ВВ между ВПЧ-положительными (SiHa, HeLa) и ВПЧ-отрицательными (C33A) клетками включают гены EVC2 (англ. Ellis van Creveld syndrome 2 gene; ген, ассоциированный с синдромом Эллиса–ван Кревельда 2), LUZP1 (англ. leucine zipper protein 1; лейцин-зипперный белок 1) и ANKS1B (англ. ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing protein 1B; белок с анкириновыми повторами и SH3-доменом B), вовлеченные в сигнальный путь Hedgehog и клеточную инвазию [38]. Также отмечено повышение мРНК Wnt7B в ВВ ВПЧ-позитивных клеток [28].

Протеомный анализ экзосом клеток HeLa выявил доминирование белков PRSS56 (англ. serine рrotease 56; сериновая протеаза 56), ALPL (англ. аlkaline рhosphatase; щелочная фосфатаза), STOM (англ. stomatin; стоматин), NPTX1 (англ. neuronal pentraxin 1; нейрональная пентраксин-1) и ALPI (англ. alkaline phosphatase intestinal; щелочная фосфатаза кишечника) при снижении уровня ITGB4 (англ. iIntegrin subunit beta 4; интегрин бета-4), CTSH (англ. сathepsin H; катепсин H), TACSTD2 (англ. tumor-associated calcium signal transducer 2; передатчик кальциевого сигнала, ассоциированный с опухолью 2), LAMB3 (англ. laminin subunit beta 3; ламинин бета-3) и S100A6 (англ. S100 calcium binding protein A6; кальций-связывающий белок S100A6) по сравнению с контрольной линией HaCaT, что связано с нарушением клеточной адгезии и ремоделированием внеклеточного матрикса [39].

Белок Wnt2B, обогащенный в экзосомах ME180, C33A, CaSki, HeLa и SiHa, индуцирует трансформацию фибробластов в ассоциированные с опухолью фибробласты (англ. cancer-associated fibroblasts, CAF) через путь Wnt/β-катенин, усиливая опухолевую прогрессию [21].

Таким образом, данные, полученные в ходе in vivo и in vitro исследований, подтверждают функциональную значимость ВВ и их компонентов в патогенезе РШМ, подчеркивая потенциал этих молекул как биомаркеров и терапевтических мишеней (табл. 3).

Внеклеточные везикулы при раке эндометрия / Extracellular vesicles in endometrial cancer

Диагностика / Diagnostics

Экзосомальные микроРНК (еxomiR) рассматриваются как перспективные неинвазивные биомаркеры при РЭ. В одном из масштабных исследований выявлено 6 miR (miR-106b-5p, miR-107, miR-15a-5p, miR-3615 ↑; miR-139-3p, miR-574-3p ↓) с AUC = 0,983 для ранней диагностики. miR-15a-5p показала AUC > 0,813 на всех стадиях. Диагностическая точность панели превысила показатели классических маркеров – CEA (англ. сarcinoembryonic antigen; раково-эмбриональный антиген) и CA-125 (англ. сancer antigen 125; раковый антиген 125) [40].

МикроРНК miR-151a-5p, несмотря на отсутствие тканевой экспрессии, демонстрировала стабильное повышение в экзосомах плазмы (AUC = 0,680) [41]. Эта miR, вовлеченная в эпителиально-мезенхимальный переход (англ. epithelial-mesenchymal transition, EMT), ранее описана при немелкоклеточном раке легкого [42][43].

МикроРНК miR-20b-5p также повышена в сыворотке и экзосомах, регулируя ангиогенез и выживаемость через путь STAT3, фактор роста сосудистого эндотелия-А (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A), PTEN и гипоксия-индуцируемый фактор 1 альфа (англ. hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α), но не обнаруживается в опухолевой ткани [44]. Напротив, miR-499 снижена в опухоли по сравнению с нормальными тканями [45].

Ассоциированные с опухолью фибробласты (CAF) продуцируют регуляторные РНК: miR-320a снижена в экзосомах CAF, в то время как lncRNA NEAT1 (англ. nuclear enriched abundant transcript 1; ядросодержащий обильный транскрипт 1) повышена [46][47].

В экзосомах перитонеального лаважа выявлены 96 miR со сниженной и 18 с повышенной экспрессией у пациенток с РЭ. Наиболее значимыми оказались miR-383-5p, miR-10b-5p, miR-34c-3p, miR-449b-5p, miR-200b-3p и др. с AUC > 0,90 [48][49].

Исследования кольцевых РНК (англ. сircular RNAs, circRNAs) показали повышение 209 и снижение 66 транскриптов в сыворотке. Наиболее значимыми были hsa_circ_0109046 и hsa_circ_0002577, вовлеченные в фокальную адгезию и ремоделирование цитоскелета. Анализ Киотской энциклопедии генов и геномов (англ. Kyoto Encyclopedia of genes and genomes, KEGG) указывает на их участие в регуляции взаимодействия с внеклеточным матриксом, в фокальной адгезии и ремоделировании цитоскелета) [50].

При выборе биоматериала для анализа учитываются устойчивость РНК и инвазивность метода. Исследование плазмы является наименее инвазивным методом, однако его результаты могут искажаться под влиянием тромбоцитов [51]. Моча требует сбора большого объема для получения достаточного количества биоматериала [52], в то время как перитонеальный лаваж, несмотря на инвазивность процедуры, может отражать наиболее объективную картину ввиду близости к опухоли [53]. Комбинация нескольких miR повышает точность диагностики и снижает затраты [41][44].

Среди белковых биомаркеров галектин-3-связывающий белок (англ. galectin-3-binding protein, LGALS3BP) и аннексин A2 (англ. annexin A2, ANXA2), обнаруженные в экзосомах клеток линии HEC-1A, показали значительное повышение у пациенток с РЭ: 5,78- и 1,41-кратное соответственно. Использование системы ExoGAG (англ. exosome glycosaminoglycan-base disolation; метод экзосомной преципитации) позволило эффективно выделять ВВ. Высокий уровень ANXA2 ассоциирован с продвинутыми стадиями по классификации FIGO (III–IV), высоким риском рецидива и неэндометриоидным типом опухоли [54][55].

В совокупности эти данные подтверждают ценность ВВ как носителей диагностически и прогностически значимой информации при РЭ (табл. 4). Однако требуется дальнейшая валидация биомаркеров в мультицентровых исследованиях.

Прогностическая значимость / Prognostic significance

Среди экзосомальных молекул при РЭ особую клинико-прогностическую значимость демонстрирует miR-15a-5p, уровень которой ассоциирован с мутацией TP53 (англ. tumor protein p53; опухолевый супрессор p53), глубокой инвазией в миометрий и увеличенным размером опухоли, что делает ее маркером агрессивности опухолевого процесса [40]. Снижение уровней miR-15a-5p и miR-106b-5p после хирургического вмешательства отражает уменьшение опухолевой массы и может служить индикатором эффективности лечения.

Пониженная экспрессия miR-148b в экзосомах CAF ассоциирована с неблагоприятным прогнозом, тогда как ее повышение – с улучшением выживаемости [56]. miR-200c, обнаруженная в повышенных концентрациях в мочевых экзосомах пациенток с РЭ, ингибирует онкоген BMI1 (англ. B-lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog; гомолог 1‑й области введения Mo-MLV при В-лимфоме) и ключевые регуляторы EMT – ZEB1 и ZEB2 [57][58]. Хотя ее повышение в моче может отражать ответ на терапию, а не активность опухоли [57], это делает miR-200c потенциальным маркером мониторинга лечения, что также подтверждено в исследованиях на модели аденокарциномы легкого [59].

Среди белковых компонентов внеклеточных везикул ключевым прогностическим маркером является белок LGALS3BP: его высокие уровни в плазме коррелируют с продвинутыми стадиями заболевания, метастазированием и ангиогенезом [60]. Иммуногистохимические данные и анализ Атласа генома рака (англ. The Cancer Genome Atlas, TCGA) Университетского портала для анализа данных TCGA (англ. University of Alabama at Birmingham Cancer data analysis portal, UALCAN) подтверждают его высокую экспрессию при серозных и смешанных гистотипах РЭ, а также связь со сниженной общей выживаемостью.

Протеомные исследования с использованием масс-спектрометрии без меток (англ. label-free quantification – mass spectrometry, LFQ-MS) позволили выявить отличия в экспрессии 33 белков в экзосомах пациенток с РЭ по сравнению со здоровыми женщинами [61]. Наиболее значимые изменения касались белков APOA (англ. apolipoprotein A; аполипопротеин A), HBB (англ. hemoglobin beta, гемоглобин бета), CA1 (англ. carbonic anhydrase 1; карбоангидраза 1), HBD (англ. гемоглобин дельта; hemoglobin delta), LPA (англ. lipoprotein(a); липопротеин(а)), SAA4 (англ. serum amyloid A4; сывороточный амилоид A4) и PF4V1 (англ. platelet factor 4 variant 1; фактор 4 тромбоцитов вариабельный 1), причем логистическая модель на основе PF4V1, CA1 и HBD позволила отличать стадии I РЭ от контроля с AUC = 0,98. Особенно интересен PF4V1, участвующий в подавлении ангиогенеза, и CA1, вовлеченная в опухолевый метаболизм.

Прогностическая значимость также показана для miR-26a-5p, уровень которой был снижен у пациенток с метастазами в лимфоузлы, с AUC = 0,834 [62]. Ее экспрессия отрицательно коррелировала с уровнем маркера лимфатического эндотелия LYVE-1 (англ. lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1; рецептор гиалуроновой кислоты 1 эндотелия лимфатических сосудов), что подчеркивает ее роль в подавлении лимфогенной инвазии. Повышение уровня miR-26a-5p после операции может служить индикатором успешности хирургического лечения.

Таким образом, экзосомальные miR и белки обладают высоким прогностическим потенциалом при РЭ, способствуя индивидуализированной оценке риска, прогнозированию течения заболевания и мониторингу эффективности терапии (табл. 5).

Функциональная валидация in vitro и in vivo / In vivo and in vitro functional validation

Функциональные исследования на клеточных моделях дополняют клинические наблюдения, позволяя уточнить молекулярные механизмы участия ВВ и их компонентов в патогенезе РЭ. В модели ксенотрансплантата с клетками ISK (англ. human endometrial adenocarcinoma cell line; клеточная линия серозной аденокарциномы эндометрия) введение экзосом, обогащенных LGALS3BP, индуцировало рост опухоли, пролиферацию (Ki-67), ангиогенез (VEGF-A, CD31) [60].

Так, экзосомы CAF с пониженной экспрессией miR-148b усиливали инвазию клеток РЭ, тогда как восстановление уровня этой микроРНК ингибировало EMT и экспрессию метастаз-ассоциированных маркеров. Показано, что miR-148b регулирует экспрессию DNMT1 (англ. DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1; ДНК-метилтрансфераза 1), снижая метилирование генов-супрессоров опухолей [56].

Аналогичным образом, miR-499, экспрессия которой снижена в опухолевой ткани при РЭ, тормозила ангиогенез и метастазирование в моделях in vitro за счет подавления онкогена VAV3 (англ. vav guanine nucleotide exchange factor 3; фактор обмена гуаниннуклеотидов Vav 3) – фактора гуанин-нуклеотидного обмена, участвующего в цитоскелетной реорганизации и клеточной миграции [45].

Особый интерес представляет микроРНК miR-26a-5p, экспрессия которой снижена при лимфогенных метастазах. В клетках лимфатического эндотелия человека (англ. human lymphatic endothelial cells, HLEC) она ингибировала миграцию и лимфангиогенез, регулируя экспрессию TFEB (англ. transcription factor EB; фактор транскрипции EB) и LEF1 (англ. lymphoid enhancer-binding factor 1; фактора 1, связывающий лимфоидный энхансер), вовлеченных в ангио- и лимфоваскулярное ремоделирование [62].

Внеклеточные везикулы, выделенные из плазмы пациенток с метастатическим РЭ, стимулировали пролиферацию опухолевых клеток ISK, SPEC2 (англ. serous endometrial carcinoma; клеточная линия, происходящая из эндометриоидного рака эндометрия, относящаяся к типу серозной карциномы эндометрия) и HUVEC (англ. human ubilical vein endothelial cells; эндотелиальные клетки пупочной вены человека), активируя путь PI3K/AKT/VEGF-A и усиливая ангиогенез [60]. Протеомный анализ экзосом клеток HEC-1A выявил обогащение белками, способствующими адгезии и миграции, в том числе молекулами клеточной поверхности и внеклеточного матрикса [54].

lncRNA NEAT1, обогащенная в экзосомах CAF, активировала сигнальный каскад STAT3/YKL-40 (англ. chitotriosidase-like protein 1; хитотриозидаза-подобный белок 1), усиливая пролиферацию и инвазию клеток HEC-1A и RL95-2 (англ. human endometrial adenocarcinoma cell line derived from a moderately differentiated, type I endometrial cancer; клеточная линия, полученная из умеренно дифференцированной аденокарциномы эндометрия человека). Более того, NEAT1 модулировала экспрессию miR-26a/b-5p, что указывает на ее регуляторную роль в формировании агрессивного фенотипа РЭ [47].

МикроРНК miR-141-3p и miR-200b-3p, синтезируемые клетками линии Ишикавы, передавались фибробластам посредством экзосом, изменяя их фенотип и стимулируя экспрессию провоспалительных и матриксных белков [63]. miR-200c, обнаруженная в мочевых экзосомах пациенток, ингибировала экспрессию BMI1, ZEB1 и ZEB2, ключевых факторов EMT, тем самым снижая инвазивность опухолевых клеток [57–59].

Отдельный интерес вызывает кольцевая РНК hsa_circ_0001610, выделенная из экзосом М2-поляризованных макрофагов. Эта circRNA снижала чувствительность клеток РЭ к радиотерапии, ингибируя miR-139-5p и активируя экспрессию циклина B1 [64].

Наконец, экзосомы при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ) передавали miR-27a-5p, ингибируя SMAD4 (англ. mothers against decapentaplegic homolog 4; сигнальный белок пути TGF-β, гомолог Drosophila MAD) и стимулируя инвазию клеток эндометриоидного рака эндометрия. Эти данные подчеркивают влияние системных метаболических нарушений на онкогенез в матке [65–67].

Таким образом, in vitro модели продемонстрировали роль ВВ и их молекулярных компонентов в модуляции пролиферации, инвазии, EMT, ангио- и лимфангиогенеза при РЭ, подтверждая их потенциальную ценность в качестве терапевтических мишеней и биомаркеров мониторинга (табл. 6).

Исследования in vivo подтвердили ключевую роль ВВ в прогрессии РЭ. Экзосомы с miR-26a-5p, введенные мышам NOD-SCID (англ. non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency; нелимфоидный диабетический/тяжелый комбинированный иммунодефицит), уменьшали массу опухоли и экспрессию Ki-67, указывая на ее противоопухолевый эффект [62].

Отдельное внимание заслуживает кольцевая РНК hsa_circ_0001610, обнаруженная в экзосомах М2-поляризованных макрофагов: в модели на мышах она снижала радиочувствительность опухоли, активируя циклин B1 через подавление miR-139-5p [64].

Таким образом, in vivo данные подтверждают ключевое участие внеклеточных везикул в регуляции пролиферации, ангиогенеза, радиочувствительности и инвазии при РЭ, подчеркивая их роль как потенциальных терапевтических мишеней.

Внеклеточные везикулы при раке яичников / Extracellular vesicles in ovarian cancer

Диагностика / Diagnostics

Рак яичников в большинстве случаев диагностируется на поздних стадиях, что обусловливает низкие показатели выживаемости и подчеркивает необходимость разработки высокочувствительных неинвазивных биомаркеров для раннего выявления заболевания [69][70]. Среди наиболее перспективных молекулярных маркеров в настоящее время активно исследуются микроРНК, ассоциированные с ВВ, благодаря их стабильности в биологических жидкостях и ключевой регуляторной роли в опухолевом процессе [70].

Клинические исследования демонстрируют высокую диагностическую ценность панелей экзосомальных miR. Так, в одном из них установлено, что малые ВВ, выделенные из сыворотки крови пациенток с РЯ, содержат специфический профиль miR, отличающийся от контрольной группы. Комплекс из 7 miR (miR-1246, miR-141-3p, miR-200a-3p, miR-200b-3p, miR-200c-3p, miR-203a-3p и miR-429) показал более высокую чувствительность и специфичность в выявлении серозного эпителиального РЯ на стадии I, чем классический маркер CA-125 (AUC = 0,903; специфичность 100 %; чувствительность 80 %) [71]. Другая диагностическая панель, включающая miR-1246, miR-1290, miR-483-5p, miR-429, miR-34b-3p, miR-34c-5p, miR-449a и miR-145-5p, также демонстрировала стабильные значения AUC свыше 0,9 при дифференциации злокачественных и доброкачественных процессов [72]. Часто повторяющиеся маркеры, в частности miR-1246 и miR-429, рассматриваются как потенциальные универсальные биомаркеры.

Высокая диагностическая значимость семейства miR-200 и miR-373 также подтверждена: их панель (miR-200a/b/c) позволила различать РЯ и доброкачественные опухоли с чувствительностью 88 % и специфичностью 90 % [73]. В ряде работ выявлены miR с наибольшим диагностическим потенциалом, среди которых особого внимания заслуживает miR-145 (AUC = 0,910) [74]. Повышение уровней miR-1307 и miR-375 в сывороточных ВВ усиливало точность диагностики при совместной оценке с CA-125 и HE4 (англ. human epididymis protein 4; человеческий эпидидимальный белок 4) [75]. Также сообщалось о значимых изменениях экспрессии miR-21, miR-100, miR-200b, miR-320 (повышены) и miR-16, miR-93, miR-126, miR-223 (снижены) [76][77]. miR-21, в частности, ингибирует опухолевый супрессор PDCD4 (англ. рrogrammed cell death protein 4; белок запрограммированной гибели клеток 4), уровень которого, в свою очередь, снижен при РЯ [78][79].

Анализ других биологических жидкостей также подтверждает диагностический потенциал ВВ. В перитонеальной жидкости пациенток с РЯ зафиксирована сверхэкспрессия miR-200c-3p, miR-18a-5p, miR-1246 и miR-1290, а также снижение уровней miR-100-5p и miR-125b-3p [80]. При серозной аденокарциноме яичников в моче наблюдалось повышение miR-30a-5p [81], что демонстрирует возможности неинвазивной диагностики. Наряду с этим, в плазме пациенток с РЯ были обнаружены повышенные уровни miR-222-3p, miR-24-3p и miR-101, хотя данные по последней остаются противоречивыми [82–84].

Помимо микроРНК, значительный интерес представляют и другие классы регуляторных РНК. Экзосомальные lncRNAs, включая SOX2-OT (англ. SOX2 overlapping transcript; транскрипт, перекрывающий ген SOX2) и circRNA, например circRNA051239, демонстрируют повышенную экспрессию у пациенток с РЯ и рассматриваются как новые диагностические мишени [85][86]. Также выявлены профили транскриптов мРНК – SPINT2 (англ. serine peptidase inhibitor, Kunitz Type 2; ингибитор сериновых пептидаз, куниц-тип 2) и NANOG (англ. nanog homeobox; гомеобокс-содержащий транскрипционный фактор) и miR (let-7b, miR-23b, miR-29a и др.) в перитонеальных ВВ, обеспечившие точность диагностики до 87,5 % [87]. Кроме того, в сыворотке пациенток с серозным РЯ поздних стадий наблюдается повышение уровня экзосомальной митохондриальной ДНК (мтДНК), что может отражать интенсивный метаболизм опухоли [88].

Протеомный анализ ВВ позволил идентифицировать ряд белков с высокой диагностической значимостью. В частности, панели, включающие MAGE3/6 (англ. melanoma-associated antigens 3 and 6; антигены меланомы человека 3 и 6), FGG (англ. fibrinogen gamma chain; гамма-цепь фибриногена), MUC16 (англ. mucin 16; муцин 16) и APOA4 (англ. apolipoprotein A-IV; аполипопротеин A-IV), обеспечили AUC до 0,945 [89–91]. Среди мембранных белков ВВ перспективными маркерами диагностики РЯ являются ACSL4 (англ. acyl-CoA synthetase long-chain family member 4; длинноцепочечная ацил-КоА-синтетаза 4), IGSF8 (англ. immunoglobulin super family member 8; член надсемейства иммуноглобулинов 8), ITGA2 (англ. integrin alpha-2; интегрин альфа-2), FRa (англ. folate receptor alpha; рецептор фолиевой кислоты альфа-типа), Claudin-3 (клаудин-3) и TACSTD2 (англ. tumor-associated calcium signal transducer 2; антиген опухолевой ассоциированной кальций-сигнальной трансдукции 2), что подтверждено с использованием нанотехнологических платформ [92–95].

Комплекс CD151/Tspan8 (англ. tetraspanin 8 and cluster of differentiation 151; тетраспанин 8 и кластер дифференцировки 151) и TSG101 (англ. tumor susceptibility gene 101; ген-супрессор опухолей 101) показал корреляцию с метастазированием и агрессивностью опухоли [83][90][96]. Дополнительно отмечено повышение уровней таких молекул, как CRABP2 (англ. cellular retinoic acid-binding protein 2; клеточный белок-связывающий ретиноевую кислоту 2), SPP1 (англ. secreted phosphoprotein 1; остеопонтин) и TNFAIP6 (англ. tumor necrosis factor alpha-induced protein 6; белок 6, индуцируемый фактором некроза опухоли альфа), а также сигнальных белков pSTAT3 (англ. phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3; фосфорилированный сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 3), HGF (англ. hepatocyte growth factor; фактор роста гепатоцитов) и IL-6 (англ. interleukin-6; интерлейкин-6), что подчеркивает необходимость интегративного подхода при анализе ВВ [97][98].

Таким образом, ВВ при РЯ представляют собой многообещающую платформу для ранней диагностики, мониторинга и потенциальной стратификации пациенток, что делает их ключевым элементом в развитии персонализированной медицины (табл. 7).

Прогностическая значимость / Prognostic significance

Экзосомальные микроРНК (miR) демонстрируют высокий прогностический потенциал при раке яичников (РЯ). В исследовании, основанном на анализе перитонеального и плеврального выпота, повышение уровня miR-21 достоверно коррелировало с неблагоприятной OS, тогда как miR-21, miR-23b и miR-29a также ассоциировались со сниженной DFS [99]. Аналогичные результаты получены при оценке сыворотки: высокие уровни miR-373, miR-200b и miR-200c связаны с ухудшением OS и рассматриваются как независимые прогностические факторы [73][75].

Экзосомальные lncRNAs, выделенные из экзосом, также обладают прогностическим значением. Высокая экспрессия lncRNA ESRG (англ. embryonic stem cell related gene; экспрессируемый в плюрипотентных стволовых клетках ген, ассоциированный с эмбриональными стволовыми клетками), обнаруженная преимущественно в перитонеальных ВВ до начала химиотерапии, ассоциировалась с более продолжительной OS [100]. Напротив, lncRNA MALAT1 демонстрировала повышение в сыворотке у пациенток с эпителиальным РЯ и коррелировала с продвинутыми стадиями по классификации FIGO, высокой степенью злокачественности, лимфогенными метастазами и сниженной OS [101].

Инновационные подходы к оценке малых внеклеточных везикул (мВВ) также подтвердили их прогностический потенциал. Так, соотношение мВВ/CA-125, предложенное М. Asare-Werehene с соавт. (2023), оказалось информативным для раннего выявления РЯ и предсказания риска рецидива и химиорезистентности: более высокие значения ассоциировались с лучшими показателями OS и DFS [102].

Кроме того, sEV-pGSN (англ. plasma gelsolin associated with small extracellular vesicles; плазматический гельсолин, ассоциированный с мВВ), оказался маркером химиорезистентности: его уровень был выше у пациенток с интервалом без прогрессирования (англ. progression-free interval, PFI) ≤ 12 месяцев. Соотношение общего гельсолина в плазме крови (англ. plasma gelsolin, pGSN) к sEV-pGSN позволяло различать чувствительные и резистентные формы заболевания с чувствительностью 73,91 % и специфичностью 72,46 % [103].

Таким образом, ВВ и содержащиеся в них биомолекулы обладают высокой прогностической ценностью, дополняя традиционные маркеры и расширяя возможности персонализированного подхода к лечению РЯ (табл. 8).

Функциональная валидация in vitro и in vivo / In vivo and in vitro functional validation

Доклинические исследования, направленные на функциональное подтверждение клинических и in vitro данных, значительно расширили понимание роли ВВ в патогенезе РЯ. В ксенотрансплантатной модели с клетками SKOV-3 показано, что уровень экзосомального TrkB (англ. tropomyosin receptor kinase B; рецептор нейротрофина тирозинкиназы типа B) в сыворотке мышей достоверно выше по сравнению с контролем, что коррелирует с прогрессией опухоли [104]. В ортотопических моделях с использованием клеток A2780 и ES-2 выявлены специфические miR в плазме (например, miR-766-3p), отсутствующие у здоровых животных, что демонстрирует потенциал экзосомальных miR как маркеров опухолевого процесса [105].

Особо значимым стало исследование с использованием онкогенных клеток маточных труб (англ. malignant fallopian tube epithelial cells, mFT), которые имплантировались мышам с целью динамического мониторинга ВВ. Уже на 9‑й день выявлено повышение содержания mFT-маркеров – PODXL (англ. podocalyxin-likeprotein 1; подокаликсинподобный белок 1), JUP (англ. junction plakoglobin; плакоглобин), TNC (англ. tenascin-C; тенасцин-С), CD24 (англ. cluster of differentiation 24; кластер дифференцировки 24), EpCAM (англ. epithelial cell adhesion molecule; молекула адгезии эпителиальных клеток) и др., достигающее пика к 30-му дню. Также зафиксировано значительное увеличение PAX8 (англ. paired box Gene 8)-положительных ВВ, что подчеркивает высокую чувствительность этой платформы для раннего выявления высокодифференцированного серозного РЯ (англ. high-grade serous ovarian cancer, HGSOC) [106].

Экспрессия экзосомальных РНК в клетках РЯ также демонстрировала значимые отличия от нормальных эпителиальных клеток. Так, miR-99a-5p, miR-1290, miR-139-5p и miR-3131 были значительно повышены в экзосомах клеток HeyA8, TYK-nu, A2780 и SKOV-3 по сравнению с иммортализованными клетками поверхностного эпителия яичников (англ. immortalized ovarian surface epithelial cells, IOSE) [107][108]. miR-215p, ранее идентифицированная как циркулирующий биомаркер, также обнаружена в экзосомах опухолевых клеток [79], а miR-21, miR-30a-5p и miR-129b-1-3p демонстрировали значительное повышение в клетках SKOV-3 [81][109]. Длинная некодирующая РНК SPOCD1-AS (англ. SPOCD1 antisense RNA; антисмысловая РНК к гену SPOCD1) и мРНК транскрипты SPINT2 и NANOG также были обогащены в экзосомах клеток SKOV-3 и OVCA-3 по сравнению с нормальными клетками [87][110].

Протеомный и липидомный анализ выявил, что экзосомы клеток SKOV-3 содержат больше холиновых эфиров, а также имеют высокий уровень белков COL5A2 (англ. collagentype V alpha 2 chain; коллаген типа V, альфа 2 цепь) и LPL (англ. lipoprotein lipase; липопротеинлипаза) [111]. Линия OAW28, устойчивая к цисплатину, выделяла более гетерогенные ВВ с преобладанием частиц > 200 нм и выраженной экспрессией EpCAM (англ. epithelial cell adhesion molecule; эпителиальный клеточный адгезивный молекулярный антиген) по сравнению с чувствительными линиями [112].

Выраженное повышение circRNA051239 и lncRNA MALAT1 установлено в высоко метастатических линиях SKOV3.ip и HO8910.PM, что предполагает участие этих РНК в метастазировании [86][101]. Ряд этих биомолекул способствует антипоптозу, онкогенезу, химиорезистентности и иммуносупрессии [79][81][85][87][88][99][109][112]. Клетки опухолевого микроокружения – CAF, адипоциты, макрофаги, мезотелиальные и эндотелиальные клетки, а также дендритные клетки также вовлечены в секрецию патогенетически значимых ВВ [77][82][90][99][101][107][109][110].

Совокупность этих данных подтверждает, что ВВ являются не только ценными биомаркерами, но и перспективными терапевтическими мишенями при РЯ (табл. 9).

Биомаркеры внеклеточных везикул при раке влагалища и вульвы / Extracellular vesicle biomarkers in vulvar and vaginal cancer

В настоящее время исследования экзосомальных биомаркеров при раке влагалища и вульвы остаются крайне ограниченными и требуют дальнейшего развития. Имеются лишь единичные публикации, в которых рассматривается участие экзосомальных компонентов в патогенезе этих редких ЗНО. Так, в одном из исследований было изучено влияние уротелиального ассоциированного с раком белка 1 (англ. urothelial cancer associated 1, UCA1), локализованного в экзосомах фибробластов, ассоциированных с опухолью, на повышение химиорезистентности клеток плоскоклеточного рака вульвы [113]. Однако систематических данных по дифференциальной экспрессии экзосомальных молекул у пациенток с раком влагалища и/или вульвы в сравнении со здоровыми контролями пока нет. В связи с этим необходимо проведение углубленных исследований, направленных на идентификацию ключевых экзосомальных биомаркеров, их функциональную характеристику и определение прогностической и терапевтической значимости в данных нозологических формах.

Заключение / Conclusion

Гинекологические ЗНО остаются серьезной медико-социальной проблемой, требующей разработки эффективных стратегий диагностики и терапии. В обзоре представлены актуальные данные о роли ВВ в патогенезе этих опухолей. Установлено, что ВВ, продуцируемые как опухолевыми, так и окружающими доброкачественными клетками, способствуют прогрессированию заболевания, модулируя клеточные взаимодействия и микроокружение.

Некодирующие РНК (miR, lncRNAs) и белки, ассоциированные с ВВ, демонстрируют потенциал в качестве биомаркеров диагностики, прогноза и оценки лекарственной чувствительности. Однако их клиническое применение требует дальнейшей валидации в масштабных исследованиях.

Будущие исследования должны опираться на интеграцию омиксных технологий с учетом стадии, гистотипа и молекулярного профиля опухоли по классификации FIGO. Такой подход обеспечит разработку персонализированных решений и повысит воспроизводимость результатов.