Клинико-иммунологическая характеристика женщин с бесплодием и привычным выкидышем в анамнезе

Введение / Introduction

В научных исследованиях по репродуктивной медицине особое место занимает изучение механизмов и особенностей эмбрионально-эндометриального диалога, целью которого является согласованные процессы адгезии, инвазии, имплантации с последующим прогрессированием беременности. При нарушении взаимодействий развивающегося эмбриона и эндометрия могут возникать нарушения репродуктивной функции, среди которых значительную распространенность получили привычный выкидыш и бесплодие. Обе патологии обладают крайне важной социальной значимостью, учитывая сложности в современной демографической ситуации в Российской Федерации и важность решения проблем повышения рождаемости и снижения репродуктивных потерь.

Самопроизвольный выкидыш – разновидность репродуктивных потерь, самой частой причиной которых являются нарушения синхронности развития эмбриона и плаценты вследствие генетических или хромосомных нарушений [1]. При наличии двух и более самопроизвольных потерь беременности в сроках до 22 недель помимо генетических проблем к причинам прерывания беременности на малых сроках при привычном выкидыше можно отнести наличие воспалительной патологии эндометрия, а также неадекватное развитие иммунных реакций в тканях плаценты с нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов, с нарушением соотношения лимфоцитов Th1/Th2 (англ. T-helper cells type 1/T helper cells type 2; T-хелперы 1-го типа/Т-хелперы 2-го типа) со смещением в сторону Th1 [2][3]. В свою очередь нарушение баланса цитокинов с изменением рецептивности эндометрия наблюдается при идиопатическом бесплодии или на последующих этапах прогрессирования гестационного процесса с их последующим влиянием на функционирование плодово-плацентарного комплекса [4].

Развитие воспалительных заболеваний эндометрия, в частности, хронического эндометрита (ХЭ) связано с бесплодием и привычным невынашиванием беременности [5][6]. ХЭ является достоверным (p < 0,05) фактором риска привычного невынашивания беременности (отношение шансов (ОШ) = 4,840; 95 % доверительный интервал (ДИ) = 1,017–23,022) [7]. Однако на сегодняшний момент остается нерешенной проблема диагностики ХЭ из-за нечеткости диагностических критериев [8]. В связи с этим представляет сложность и определение истинной распространенности данной патологии, которая по данным литературы составляет при бесплодии от 2,8 до 56,8 % [9], а при привычном выкидыше – от 9 до 56 % [10].

Установлена связь воспалительной патологии эндометрия и изменений в балансе и составе микробиоты как репродуктивного тракта, так и желудочно-кишечного тракта. Нарушение микрофлоры влагалища ассоциировано с бесплодием [11][12] и самопроизвольным выкидышем [13]. Известно, что в рамках программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) неудачи имплантации и привычный выкидыш отмечены увеличением разнообразия микробиома и уменьшением доминирования Lactobacillus в нижних отделах женской репродуктивной системы. В присутствии сниженного числа Lactobacillus и/или при наличии патогенов в полости матки при повторных отсутствиях имплантации и привычной потере беременности происходит формирование провоспалительных иммунных реакций [14][15]. Крайне важным направлением в молекулярной диагностике и в микробиологических исследованиях является изучение эубиотических и дисбиотических процессов в эндометрии, так как при низком уровне комменсальных бактерий за счет продукции антимикробных пептидов (англ. antimicrobial peptides, AMP), хемокинов и цитокинов эпителиальными клетками происходит поддержание адекватного иммунного и воспалительного ответа в эндометрии. Комменсалы/их метаболиты взаимодействуют с антигенпрезентирующими клетками для обеспечения иммунотолерантного состояния посредством влияния на Т-клеточный иммунитет. При дисбиотических состояниях снижается число AMP, изменяется продукция хемокинов, цитокинов, нарушается целостность и проницаемость эпителиального слоя. Все вышеперечисленные процессы способствуют бактериальной колонизации и запуску провоспалительного пути с последующим нарушением процессов ангиогенеза, рецептивности эндометрия и нарушением прогрессирования беременности [16].

Помимо регламентированных клиническими рекомендациями исследований по выявлению инфекционно-воспалительных заболеваний генитального тракта и бактериального вагиноза (микроскопия мазка, молекулярно-генетическая диагностика абсолютных патогенов) и диагностики ХЭ [17][18] существует возможность оценки взаимодействия организма и микробиоты через оценку экспрессии про- и противовоспалительных факторов и их ассоциации с представителями микробиоты. Учитывая инвазивную процедуру забора и сложности в интерпретации результатов молекулярного/культурального исследования содержимого из полости матки (возможность контаминации при заборе, крайне низкие концентрации ДНК в образцах), важным этапом до проведения расширенного исследования микробиоты репродуктивных путей является уточнение клинических характеристик анамнеза женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и с невынашиванием беременности на прегравидарном этапе обследования с дополнительной оценкой экспрессии матричной РНК (мРНК) генов врожденного иммунитета.

Цель: провести комплексный анализ клинических, анамнестических и иммунологических данных у женщин с бесплодием и/или привычным выкидышем в анамнезе.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

На базе 2-го акушерского отделения патологии беременности и отделения вспомогательных технологий лечения бесплодия имени Б.В. Леонова ФГБУ НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова Минздрава России проведено поперечное одномоментное исследование, включившее 302 женщин, планирующих беременность.

Пациентки были распределены на 3 группы: группа 1 – 108 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием и неудачными попытками ЭКО, группа 2 – 53 пациентки с бесплодием и привычным выкидышем, группа 3 – 141 женщина с привычным выкидышем. Включенным в исследование женщинам проводился анализ гинекологического, акушерского, репродуктивного анамнеза, результатов ультразвукового исследования (УЗИ) органов малого таза с последующей оценкой экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета в соскобе слизистой оболочки цервикального канала.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения: возраст от 18 до 42 лет; регулярный менструальный цикл; для групп 1 и 2 – длительность бесплодия до 5 лет; трубно-перитонеальный фактор бесплодия, подтвержденный по данным гистеросальпингографии (ГСГ)/эхо-ГСГ или по данным выписки после проведения лапароскопической операции (интраоперационно: нарушение проходимости маточных труб или спаечный процесс в области придатков матки); наличие 2 и более клинических потерь беременности в сроки до 22 недель; для группы 3 – наличие 2 и более клинических потерь беременности в сроки до 22 недель; подписанное информированное согласие.

Всем пациентам, включенным в исследование, проведено УЗИ органов малого таза с целью диагностики гинекологической патологии.

Критерии исключения: острые воспалительные заболевания или хронические заболевания в стадии обострения; тяжелая экстрагенитальная патология; онкологические и аутоиммунные заболевания; обострение хронических соматических заболеваний; выраженная тератозооспермия у партнера; наружный генитальный эндометриоз III–IV стадии распространения; хроническая ановуляция; пороки развития половых органов; гинекологическая патология, требующая хирургического лечения (деформирующая полость матки, субмукозная миома, интерстициальная и/или субсерозная миома матки более 4 см, доброкачественные новообразования яичников более 3 см); патология кариотипа; отказ от проведения или отсутствие результатов УЗИ органов малого таза; отказ от участия в исследовании.

Методы исследования / Study methods

Алгоритм обследования включал в себя УЗИ органов малого таза с целью оценки размеров, структуры матки, шейки матки, яичников, диагностики объемной гинекологической патологии. Диагностическая манипуляция проводилась трансвагинальным датчиком в фолликулярную фазу менструального цикла (5–8‑й дни менструального цикла) на аппарате экспертного класса Voluson E8 BT13 (GE Healthcare, США).

Обследование на наличие локального воспалительного процесса в соскобе эпителиальных клеток слизистой оболочки цервикального канала проводили методом РНК-профилирования. Для измерения уровней экспрессии мРНК генов применяли метод количественной полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени с предварительной стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Данную методику использовали с привлечением «Набора реагентов для определения профиля экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета с целью оценки локального воспаления нижних отделов женского репродуктивного тракта методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» (ИммуноКвантэкс C/V ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Учитывали уровень экспрессии 8 генов: интерлейкинов (англ. interleukin, IL) IL-1β, IL-10, IL-18, фактора некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), толл-подобного рецептора 4 (англ. toll-like receptor 4, TLR4), GATA-связывающего белка 3 (англ. GATA-binding protein 3, GATA3), кластера дифференцировки 68 (CD68), β₂-микроглобулина. Полученный экспрессионный профиль сравнивали с профилем, характерным для локального воспаления. Мерой сходства является индекс воспаления (ИВ), рассчитанный методом бинарной логистической регрессии с помощью программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96 в модификации ДТПрайм М1 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) в автоматическом режиме. При величине ИВ более 60 % регистрировалась локальная воспалительная реакция в соскобе слизистой оболочки цервикального канала [19].

Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были подобраны с учетом структуры генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и референсных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой.

Выделение нуклеиновых кислот для определения экспрессии мРНК проводили с использованием комплекта реагентов ПРОБА–НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Метод использует лизис клеток с последующей депротеинизацией и осаждением нуклеиновых кислот. Объем образцов после выделения составил 100 мкл.

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистический анализ выполнен в среде R v 4.4.3 (RStudio 2023.06.1 Build 524, 2009-2023 Posit Software, PBC, США). Сравнение данных производили с использованием параметрических методов статистики. Сравнение групп проведено в режиме попарного сравнения при помощи критериев Фишера (для бинарных данных), t-теста Стьюдента–Уэлча (для количественных данных); t-тест Стьюдента–Уэлча использовали для сравнения выборок при отсутствии равенства дисперсий (поправка Уэлча). Равенство дисперсий между выборками определяли при помощи критерия Левене. Вывод о статистической значимости результатов делали при значении р < 0,05.

Для представления бинарных данных использовали следующие параметры: n – число пациентов с признаком, N – размер группы, % – доля пациентов с признаком. Для представления количественных данных использовали следующие характеристики: Me – медиана, Q₁ и Q₃ – 25 % и 75 % квартили.

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

В таблицах 1 и 2 представлены результаты анализа возрастных, массо-ростовых характеристик (с учетом распространенности избыточной массы тела и ожирения), данные соматического анамнеза.

Женщины с сочетанной патологией (группа 2) были старше, чем пациентки групп 1 и 3, однако все медианы возрастов всех групп находились не в позднем репродуктивном возрасте (период, когда более важным в причинах развития репродуктивных потерь на ранних сроках беременности становятся возраст-ассоциированные анэуплодии эмбрионов). Группы исследования были сопоставимы по таким параметрам, как индекс массы тела, избыточная масса тела, распространенность ожирения, соматическая патология (табл. 2), за исключением большей частоты встречаемости доброкачественных заболеваний молочных желез в группе 1 по сравнению с группой 3, что позволяло с полным основанием далее проводить оценку и сравнение особенностей анамнеза между группами.

Далее был проведен анализ гинекологической заболеваемости (табл. 3).

Важным этапом в алгоритме обследования женщин с репродуктивными потерями и бесплодием является проведение УЗИ органов малого таза с оценкой состояния эндометрия, которая позволила выявить сопоставимую между группами распространенность признаков ХЭ (р > 0,05). Полип эндометрия по данным УЗИ был выявлен в группе 1 в 11,1%, в группе 2 – в 3,8 % случаев и у 4,3 % женщин группы 3 (р > 0,05). Ультразвуковая диагностика ХЭ и полипов эндометрия в ряде случаев (согласно клиническим рекомендациям «Привычный выкидыш») – идиопатический привычный выкидыш, повторные неудачи имплантации – позволяет своевременно направить женщину для гистологической верификации воспалительных изменений в эндометрии с последующим проведением антибактериальной терапии [17][18], так как в основе локальных иммунных факторов в патогенезе ХЭ важное место занимает измененная микробиота с ее триггерными эффектами развития воспаления [6]. Ограничением нашего исследования является отсутствие проведения гистологической верификации ХЭ при наличии УЗИ-признаков воспалительной патологии эндометрия, однако следует принимать во внимание существование ограничений в использовании как морфологических (сложности идентификации эндометриальных стромальных плазматических клеток), так и иммуногистохимических критериев ХЭ (отсутствие международных технических стандартов в исследовании CD138 – маркера плазматических клеток) [20].

Внутриматочные синехии, диагностируемые по данным УЗИ, чаще встречались у женщин группы 3 (14,9 %; р_1–3 = 0,022) и группы 2 (17 %; р_1–2 = 0,022) по сравнению с группой 1 (4,6 %). Данная патология является следствием перенесенного инфекционно-воспалительного процесса в эндометрии или хирургической травмы. В свою очередь по данным литературы отмечена большая распространенность выкидышей и нежелательных исходов беременности после хирургического рассечения синехий [21]. Учитывая сопоставимую распространенность между группами гистероскопий в анамнезе и ХЭ по данным УЗИ, представляется наиболее вероятным образование синехий в результате реализации инфекционного процесса в полости матки. В свою очередь рассечение внутриматочной перегородки в анамнезе чаще встречалось в группе 2 привычного выкидыша и бесплодия (17,0 %) по сравнению с группой 1 только с бесплодием (1,9 %; р_1–2 = 0,003), что, вероятно, связано с более активной хирургической тактикой при наличии сочетанной патологии по сравнению с ведением пациенток только с бесплодием. Среди причин обоснования подобной терапии можно выделить такие требующие коррекции патологические факторы, как нарушения васкуляризации, сократимости, структуры фиброзной ткани самой перегородки и неадекватную реакцию эндометрия на гормональные стимулы при сопутствующем отягощенном анамнезе [22]. При анализе встречаемости такого хирургического подхода как миомэктомии в анамнезе статистически значимые отличия в группах не определены (р > 0,05).

При анализе распространенности наружного генитального эндометриоза в анамнезе более частая встречаемость данной патологии по сравнению с пациентками с привычным выкидышем (группа 3) определена в группе сочетанной патологии (группа 2) – 7,8 и 24,5 % (р_2–3 = 0,009). Хотя разница между показателями при попарном сравнении между другими группами не достигала статистической значимости (р_1–2 > 0,05; р_1–3 > 0,05), стоит обратить внимание на показатель в группе бесплодия (группа 1), составивший 15,7 %. Влияние эндометриодных гетеротопий на фертильность обусловлено как наличием воспалительных изменений в перитонеальной жидкости, пролиферацией макрофагов и фагоцитарной дисфункцией с нарушением цитокинового баланса, окислительным стрессом, так и сопутствующими изменениями в эндометрии с формированием резистентности к прогестерону [23], а также наличием большего числа хирургических вмешательств, влияющих на овариальный резерв. Так, у пациентов с изолированным бесплодием (группа 1) по сравнению с привычным выкидышем (группа 3) чаще определены резекции яичников в анамнезе (21,3 и 7,8 %; р_1–3 = 0,008).

Несмотря на невключение в исследование женщин с нерегулярным циклом и ановуляторным бесплодием, большая распространенность УЗИ-признаков мультифолликулярных яичников определена в группе бесплодия (группа 1) и группе сочетанной патологии (группа 2) по сравнению с женщинами с привычным выкидышем (группа 3) – 11,1, 11,3 и 2,8 % (р_1–3 = 0,04; р_2–3 = 0,04), что может быть обусловлено включением пациенток с овуляторными фенотипом синдрома поликистозных яичников (фенотип С).

В репродуктивном анамнезе (табл. 4) в группе сочетанной патологии (группа 2) по сравнению с группой бесплодия (группа 1) отмечено большее число беременностей (4,0 [ 3,0; 4,0] и 1,0 [ 0,0; 1,0]; р_1–2 < 0,001), доли самопроизвольных выкидышей (50,9 % и 5,6 %; р_1–2 < 0,001), распространенности вторичного бесплодия (24,5 и 11,1 %; р_1–2 < 0,001) и количества попыток ЭКО (1,0 [ 0,0; 3,0] и 0,0 [ 0,0; 2,0]; р_1–2 = 0,002).

Определение уровней экспрессии генов врожденного иммунитета с целью оценки локального воспалительного процесса в соскобе эпителиальных клеток слизистой оболочки цервикального канала продемонстрировало разницу в уровнях экспрессии мРНК гена IL-1β в группе бесплодия (группа 1) и у пациенток с привычным выкидышем в анамнезе (группа 3) – – 4,6 [ 3,5; 5,3] и 4,9 [ 4,1; 5,8] (р_1-3 = 0,044). При анализе остальных параметров различия между группами были статистически незначимыми (р > 0,05) (табл. 5).

Интерлейкин-1β входит в состав семейства IL-1, является провоспалительным медиатором, вырабатываемым дендритными клетками, моноцитами крови, Т-клетками и тканевыми макрофагами. IL-1β играет важную роль в децидуализации стромальных клеток, наиболее высокий уровень его экспрессии клетками цитотрофобласта определен в I триместре беременности, описано его протромботическое влияние на систему гемостаза, особенно при наличии антифосфолипидных антител [24].

По данным литературы, оценка связи уровня IL-1β и исходов беременности продемонстрировала противоречивые результаты [24]: определены как низкие уровни IL-1β в эндометрии женщин с привычным выкидышем, так и высокие показатели экспрессии при данной патологии.

При изучении роли IL-1β в патогенезе повторных неудач имплантаций определено нарастание его концентрации в крови в случае прогрессирования беременности и отсутствие подобной тенденции при отрицательном тесте на беременность или при ее последующем прерывании [25]. Анализ связи концентраций IL-1β в эндометриальной жидкости и исходов беременности продемонстрировал противоположные результаты [26].

Учитывая выявленную в нашем исследовании разницу в уровнях экспрессии гена IL-1β в группах бесплодия (группа 1) и привычного выкидыша (группа 3) на фоне высоких интегральных показателей индекса воспаления во всех изученных группах (ИВ > 60 %; р > 0,05), можно предположить разные механизмы реализации нарушений эндометриально-эмбрионального диалога на общем воспалительном фоне. Определены разные временные характеристики влияния данного интерлейкина, в том числе его более выраженное участие не на этапах имплантации, а на более поздних этапах прогрессирования беременности [26].

Заключение / Conclusion

В репродуктивном тракте женщины взаимодействие комменсальной флоры и локального иммунитета в норме осуществляется через контролируемые воспалительные реакции. Распространенность ХЭ как проявления воспалительной реакции слизистой оболочки по данным УЗИ у женщин с привычным выкидышем и бесплодием, а также в группе сочетанной патологии может достигать 20 %. У женщин с сочетанием привычного выкидыша и бесплодия по сравнению с группой пациенток с бесплодием в анамнезе чаще определены внутриматочные синехии как проявление выраженного перенесенного инфекционного процесса в полости матки.

При сочетании хронической воспалительной патологии эндометрия с активацией локального иммунитета по данным исследования экспрессии генов врожденного иммунитета, особенно на фоне дисбиотических нарушений микрофлоры крайне важным у женщин с репродуктивными потерями в анамнезе является проведение подготовительных мероприятий на прегравидарном этапе, целью которых является коррекция микробиоценоза, учитывая высокий риск реализации инфекционно-воспалительных осложнений беременности.

Выявленная разница в экспрессии одного из генов врожденного иммунитета – гена IL-1β, кодирующего один из ключевых провоспалительных медиаторов, у пациентов с бесплодием и привычным выкидышем, а также отсутствие статистической значимости при сравнении данных групп с группой сочетанной патологии подразумевает разные механизмы нарушений эмбрионально-эндометриального диалога и/или различные временные периоды влияния данного интерлейкина на прогрессирование нарушений во взаимодействии развивающегося эмбриона и организма матери.

Представленные данные особенностей гинекологического, акушерского, репродуктивного анамнеза подтверждают важность комплексного подхода в оценке роли инфекционного фактора в генезе нарушений репродуктивной функции.