Поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия как метод диагностики доброкачественных образований яичников у беременных

Введение / Introduction

Выявление доброкачественных образований яичников (ОЯ) в последние годы имеет тенденцию роста, чаще встречается у женщин репродуктивного возраста [1]. Частота сочетания беременности с ОЯ составляет от 2 до 20 на 1000, что примерно в 2–20 раз выше, чем в общей популяции того же возраста [2]. Данная патология относится к числу «случайных находок» при проведении планового ультразвукового исследования (УЗИ) в I триместре [3]. Наиболее распространенными типами ОЯ во время беременности являются дермоидные кисты (32 %), эндометриомы (15 %), функциональные кисты (12 %), серозные цистаденомы (11 %) и муцинозные цистаденомы (8 %). Примерно 2 % ОЯ во время беременности являются злокачественными. Хотя большинство ОЯ во время беременности можно безопасно наблюдать, и примерно в 70 % случаев они разрешаются спонтанно, в меньшинстве случаев требуется хирургическое вмешательство из-за симптомов, риска перекрута или подозрения на злокачественное новообразование. УЗИ является основой оценки ОЯ во время беременности из-за точности, безопасности и доступности. Данный метод увеличивает частоту выявления опухолей яичников в I триместре беременности, но в тоже время на больших сроках увеличенная матка с околоплодными водами создает ограничение для диагностики ОЯ, что влияет на тактику ведения и лечения пациенток [2]. Следующим методом исследования и диагностики ОЯ является определение содержания специфических и неспецифических опухолевых маркеров [4]. Однако у беременных данные показатели могут иметь ложноположительный результат, что приводит к диагностическим ошибкам и свидетельствует о нецелесообразности их использования [5][6]. При сложных клинических случаях по показаниям возможно использование дополнительных методов исследования, таких как компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (MPT) без контрастирования [7][8]. Однако данные методы исследования во время беременности не дают полной картины и могут даже оказаться ошибочными, что в свою очередь повышает риск, неблагоприятно влияющий на течение беременности и ее исход [3][9].

В связи с этим возрастает актуальность поиска новых диагностических маркеров для определения ОЯ. В последние годы появились данные об использовании поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (англ. surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS) в медицине, биологии, фармации, криминалистике и других областях науки, которая позволяет быстро идентифицировать объекты исследования путем изучения рассеянного света [10]. Основными достоинствами SERS являются отсутствие пробоподготовки и малые количества объекта исследования. Уникальность данного метода заключается в том, что можно получить необходимую информацию о конформации и микроокружении молекул живых клеток бесконтактно. Выявление различий спектральных характеристик тканей органов малого таза у женщин с патологией по сравнению с нормальной тканью показывает перспективы применения SERS в гинекологической практике [11].

Цель: изучить спектральные особенности плазмы крови у беременных с доброкачественными ОЯ.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

В ретроспективное исследование, проведенное в период с 2021 по 2023 гг., были включены 100 беременных во II и III триместрах беременности. Все беременные были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России от 20.10.2020 N 1130н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология"» [12].

Выделены 2 группы: в основную группу вошли 50 беременных с ОЯ, в контрольную группу – 50 беременных с нормально протекающей беременностью.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в основную группу: возраст от 18 до 45 лет включительно; наличие доброкачественных ОЯ; информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: возраст от 18 до 45 лет включительно; отсутствие патологических изменений и объемных образований в проекции матки и маточных придатков по результатам УЗИ органов малого таза (ОМТ); информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: возраст моложе 18 и старше 45 лет; наличие в анамнезе злокачественных новообразований любых других локализаций; наличие острых воспалительных заболеваний ОМТ; беременность, наступившая в результате вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ); состояние беременной, которое, по мнению врача, может угрожать ее безопасности при выполнении любой процедуры, предусмотренной в рамках исследования; отказ от участия или отсутствие информированного согласия.

Методы исследования / Study methods

Проведен анализ спектров SERS плазмы беременных с ОЯ и с нормально протекающей беременностью. Отбор проб венозной крови осуществляли в сроке от 15 до 36,6 нед в обеих группах однократно и повторно у беременных основной группы после удаления ОЯ в сроке от 15,3 до 28,5 недель.

Метод SERS в клинической практике является малоинвазивным, безболезненным и не представляет угрозу осложнений, основан на взаимодействии света с легкодоступными биожидкостями, включая кровь, мочу или слюну [13]. Для исследования спектральных характеристик биологической жидкости с помощью SERS был использован экспериментальный стенд, состоящий из спектрометрической системы Raman Life RL785 (ООО «ФОТОН-БИО», Россия) на основе ПЗС-детектора и микроскопа ADF U300 (ADF, Китай).

Исследование проводили на рамановском микроскопе в режиме SERS-сигнала (капля исследуемой пробы 5 мкм наносится на поверхность специальной наноостровковой SERS-подложки). Технология получения SERS-подложки, используемой в нашем исследовании, подробно изложена в работе М.В. Зуева [14]. С помощью программы EnSpectr для регистрации спектров использовали объектив LMPlan, замер осуществляли при длине волны 785 нм в области от 300 до 1700 нм со спектральным разрешением 6–8 нм при увеличении 50×6 и мощностью излучения 20 мВт, при этом время экспозиции составило 2000 мс, а количество усреднений – 10. Предварительно проводили запись окружающего фонового сигнала, позднее автоматически вычитая его из последующих регистрируемых спектров исследуемых образцов плазмы.

Для спектрального анализа были допущены образцы плазмы беременных с подтвержденным как клинически, так и гистологически диагнозом «доброкачественное образование яичников». В общей сложности было получено 50 образцов плазмы крови беременных с ОЯ (основная группа) и 50 образцов нормальной плазмы от здоровых женщин (контрольная группа).

Отдельно исследовали плазму женщин с ОЯ во время беременности и плазму крови тех же беременных уже после удаления ОЯ (группа сравнения). В эту группу вошли 8 женщин.

Подготовка образцов

Кровь отбирали в вакуумные пробирки с ЭДТА-К2. Плазму получали путем центрифугирования крови продолжительностью 5 мин при 3000 оборотов в минуту. Полученную плазму переливали в пустую стерильную пробирку без дополнительных компонентов и замораживали при температуре –18 °С для дальнейшего исследования. Образцы плазмы были нанесены на гладкую, фольгированную, твердую поверхность путем капельного нанесения для дальнейшего высыхания на воздухе. После высыхания для каждого продукта были выбраны 3 точки фокусировки, откуда были собраны рамановские спектры. Окончательный спектр получен путем усреднения трех регистрируемых спектров. Все данные были собраны в одних и тех же условиях.

Статистический анализ / Statistical analysis

Пиковые значения рамановских спектров были оцифрованы и введены в таблицу типа «объект-признак» в среде программного пакета Statistica 10 (StatSoft Inc., СШA) [15] в виде «профилей описания» спектрограмм (длина волны в нм – амплитуда в относительных единицах) для всех женщин. При этом в такой профиль были включены только те пики, для которых по литературным данным [16–21] было известно, что они соответствуют определенным веществам: 491 нм, 596 нм, 632 нм, 725 нм, 808 нм, 886 нм, 1004 нм, 1055 нм, 1132 нм, 1202 нм, 1328 нм, 1440 нм, 1567 нм и 1655 нм. Далее в каждой группе массивы данных по каждому пику спектрограммы при помощи критерия Колмогорова–Смирнова были проверены на «нормальность». Поскольку ни в одном случае их нельзя было рассматривать в качестве модификации «нормального распределения», при формировании групповых профилей спектрограмм вместо усреднения использовался расчет медиан, квартилей [Q₂₅; Q₇₅] и границ вариации (Мin–Мax). Для наглядности медианные значения были соединены линией, полученной путем сплайн-экстраполяции в графическом редакторе Statistica 10. Полученные данные и обследования вносились в специально сформированную карту и в электронные таблицы Statistica 10. Статистический анализ данных также проводили с помощью программного обеспечения Statistica 10. Для оценки значимости межгрупповых различий использовали тест Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Расчет рангового коэффициента осуществляли методом корреляции Кендала [22].

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

Сравнение паттернов рамановских спектров образцов плазмы беременных основной и контрольной групп приведено на рисунке 1. Как видно, в обеих группах наиболее представительными по степени выраженности являются пики, соответствующие L-аргинину (491 нм), L-тирозину (632 нм) и D-маннозе (1132 нм). При этом практически по всем пикам границы вариации амплитуд не пересекаются, т. е. межгрупповые различия являются значимыми и без проверки специальными критериями. Почти совпадающие значения имели место только для длин волн 1567 нм (валин) и 1655 нм (тимин), однако проверка по критерию Манна–Уитни показала, что и в этих двух случаях различия оказались хотя и малосущественными, но значимыми (Z = 7,2 и Z = 6,1; p < 0,0001).

Для удобства сравнительного анализа различия по всем пикам сведены в таблицу 1, где знаком «+» отмечены случаи, когда интенсивность пика, соответствующего данному веществу, в одной группе значимо выше, чем в другой. Хорошо видно, что в основной группе с новообразованиями яичников содержание L-аргинина, фосфатидилинозитола, L-тирозина, глутамата, D-галактозамина, фенилаланина и D-маннозы выше, чем в контрольной группе, причем для L-тирозина это превышение очень рельефное и в относительном и абсолютном смысле. В контрольной группе значимо больше присутствие аденина, триптофана, коллагена, валина и тимина, причем для аденина это превышение также носит достаточно резкий характер.

Такое же сравнение было произведено для группы женщин до и после удаления ОЯ (рис. 2). Как можно видеть, между состояниями «до» и «после» удаления ОЯ различия интенсивности пиковых значений в принципе аналогичны тем, что имели место при сравнении основной и контрольной групп. После удаления ОЯ пиковые значения спектра оказались значимо и существенно ниже для L-аргинина (491 нм), фосфатидилинозитола (596 нм), L-тирозина (632 нм), глутамата (808 нм), D-галактозамина (886 нм) и D-маннозы (1132 нм), а для аденина (725 нм) и коллагена (1440 нм) выше, чем до удаления. Следовательно, имело место практически такое же соотношение, как между основной и контрольной группами.

В этой связи мы решили сравнить спектральные паттерны в группе после удаления ОЯ и в контрольной группе (рис. 3). Как видно, паттерны спектров этих групп практически совпадают, хотя в контрольной группе имело место существенное превышение по L-аргинину (491 нм) и триптофану (1328 нм). Расчет рангового коэффициента корреляции Кендала [22], не требующего допущения о «нормальности» сравниваемых числовых рядов, показал, что по профилю и величине пиковых значений эти паттерны практически идентичны (τ = 0,91; p < 0,0001).

Различия между спектральными паттернами до удаления ОЯ и контрольной группой (рис. 4) оказались фактически такими же, что и между основной и контрольной группами. Соответственно, корреляция паттерна пиковых значений спектров, полученных до удаления ОЯ и в контрольной группе, кратно слабее и незначима (τ = 0,36; p > 0,07), причем столь же слабая корреляция (τ = 0,36) имела место между паттернами, полученными до и после удаления ОЯ. Отметим также, что корреляция паттерна пиковых значений спектров основной и контрольной групп также существенно слабее, чем между состоянием после удаления ОЯ и контрольной группой (τ = 0,56; p < 0,006 против τ = 0,91; p < 0,0001). Напротив, корреляция паттернов спектров до удаления ОЯ и в основной группе оказалась очень тесной (τ = 0,80; p < 0,0001), т. е. это идентичные по проявлениям спектра состояния. Это позволяет предположить, что удаление ОЯ приводит к восстановлению картины рамановского спектра до вида и уровня, характерного для женщин с нормально протекающей беременностью.

Сравнение спектров плазмы основной группы по отношению к контрольной выявило значительные различия в спектральных интенсивностях. По полученным результатам можно сделать вывод, что небольшое отличие пика одного спектра от другого значительно влияет на состав и концентрацию различных компонентов в жидкостях, что в свою очередь позволяет определить принадлежность плазмы к одной из групп. Повышенный сигнал в пиках 725 нм (δ(C–H)–аденин, коэнзим А), 1328 нм (триптофан), 1567 нм (валин) и 1655 нм (тимин) у контрольной группы по сравнению с основной группой указывает на относительно сниженное количество оснований нуклеиновых кислот в плазме у беременных с ОЯ.

В основной группе наиболее представительными по степени выраженности были пики, соответствующие L-аргинину (491 нм), фосфатидилинозитолу (596 нм), L-тирозину (632 нм), глутамату, D-галактозамину, фенилаланину и D-маннозе, это объясняет повышенное содержание аминокислот и сахаридов у женщин с ОЯ, что связано с аномальным метаболизмом [23] и свидетельствует о специальных биохимических изменениях количества или структуры образцов плазмы. Имеет смысл отметить, что пик D-маннозы (1132 нм) в основной группе имеет более высокую интенсивность из-за нарушения процесса гликолиза и окисления пировиноградной кислоты (цикл Кребса) [24]. Показательно, что исследователи отмечают более низкое содержание коллагена в группе женщин, которые имеют ОЯ, по сравнению с контрольной группой, что объясняется истощением резерва цитоплазматического муцина и повышенной концентрацией матриксных металлопротеиназ (англ. matrix metalloproteinases, ММРs) ММР-1, ММР-8, ММР-13, которые участвуют в расщеплении коллагена [23]. Стоить также отметить, что по нашим результатам гистологического исследования, ОЯ были представлены муцинозной цистоаденомой, серозной и эндометриоидной кистами, кистой желтого тела, т. е. носили доброкачественный характер. В мировой и отечественной литературе встречаются работы, в результате которых было установлено, что рамановские спектры новообразований яичников указывают на большее содержание в исследуемой плазме белков и более низкое содержание ДНК и липидов [24], а большинство исследований направлено на выявление злокачественных образований [25]. В нашей работе мы показали диагностическую ценность метода SERS и возможность его использования во время беременности. Тем не менее для получения более точных и прогностически значимых результатов требуется дальнейшее исследование в данной области.

Заключение / Conclusion

Различия в интенсивности пиков у беременных с ОЯ и без патологии отражают серьезные различия в составе и концентрации различных компонентов в тканевых жидкостях, что в свою очередь потенциально позволяет определить принадлежность плазмы к одной из этих групп. Выявлены изменения в биохимическом составе плазмы крови у беременных с доброкачественными ОЯ в виде наличия повышенной интенсивности в 6 пиках и восстановление картины рамановского спектра до характерного для женщин с нормально протекающей беременностью после удаления ОЯ. Данный метод исследования может быть использован в качестве дополнительного диагностического критерия для неинвазивной диагностики ОЯ у беременных.