Частота обнаружения и длительность циркуляции маркеров антифосфолипидного синдрома у пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19

Введение / Introduction

Антифосфолипидный синдром (АФС) является приобретенным и потенциально опасным для жизни пациентов симптомокомплексом, который обусловлен синтезом антифосфолипидных антител (аФЛ). Одними из триггеров развития АФС являются инфекционные заболевания [1]. В настоящее время описаны случаи выявления аФЛ у больных COVID-19, что свидетельствует о высоком риске возникновения артериальных и венозных тромбозов у таких пациентов [2][3]. Показано сродство диффузной коагулопатии при COVID-19 с развитием катастрофического АФС, который часто заканчивается фатально [2].

Согласно международным рекомендациям (XI Международный конгресс по аФЛ, 2006, Сидней) лабораторным критерием АФС является выявление волчаночного антикоагулянта (ВА) и/или антикардиолипиновых антител IgG/IgM (англ. anti-cardiolipin antibodies, aCL) и/или антител к β₂-гликопротеину 1 (англ. anti-β₂-glycoprotein 1 antibodies, аβ₂-GP1) IgG/IgM. В качестве дополнительного исследования при подозрении на АФС и отрицательных результатов на вышеуказанные маркеры рекомендуется определение aCL IgA и аβ₂-GP1 IgA [4–6]. Значительный интерес в качестве более специфичного маркера АФС представляют антитела к отдельным доменам (D) β₂-GP1. Так, субпопуляция антител к D1 (аD1-β₂-GP1) предполагается в основном ответственной за развитие тромбозов при АФС [7][8]. Доказательное значение в диагностике АФС антител к другим фосфолипидам и кофакторным белкам, таким как фосфотидилсерин-протромбиновый комплекс (англ. phosphatidylserine-prothrombin complex, PS-PT) в настоящий момент рассматривается. В ряде случаев обнаружение этих антител рассматривается как «пре-АФС»/«вероятный АФС» и предшествует развитию тромботических осложнений [9]. Определенный профиль аФЛ может быть идентифицирован как высокий/низкий риск последующего развития тромбозов, а также может коррелировать с тяжестью течения заболевания [10][11].

К настоящему времени отечественному здравоохранению доступен целый ряд зарубежных коммерческих тестов, и практически нет отечественных аналогов для определения аФЛ. Вместе с тем стандартизация и сходимость результатов лабораторных тестов разных производителей по отдельным маркерам АФС остаются существенной проблемой, что ведет к ошибкам в диагностике аутоантител. Расхождение результатов тестирования на наличие аФЛ обусловлено гетерогенностью методик выявления, вариабельностью используемых реагентов, отсутствием общепризнанных международных стандартов и единиц измерения концентрации аутоантител [12].

Цель: разработать иммуноферментные тесты для определения маркеров АФС и определить частоту обнаружения трех типов аФЛ у пациентов с COVID-19 на разных стадиях заболевания.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

Проведено сравнительное продольное контролируемое исследование, обследованы 120 человек в возрасте 18–67 лет с диагнозом COVID-19, подтвержденным с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). У большинства пациентов заболевание протекало в среднетяжелой (68,5 %) или легкой форме (26,2 %), тяжелая форма COVID-19 установлена у 3,0 % обследованных, и в 2,3 % случаев инфекция протекала бессимптомно. Больные в острой фазе COVID-19 проходили лечение в амбулаторных условиях или наблюдались в стационаре (на базе ФБУЗ «Приволжский окружной медицинский центр» ФМБА, Нижний Новгород), сбор клинического материала для исследования проводили на сроке 2–4 недели от постановки диагноза. Реконвалесценты COVID-19 (доноры ГБУЗ «Оренбургская областная клиническая станция переливания крови», Оренбург) были обследованы в динамике: через 1,5, 3,5 и 9 мес от постановки диагноза. Данные о сроках инфицирования взяты из анамнеза пациентов. В качестве контрольной группы использовали 60 образцов сыворотки крови доноров, собранные до ноября 2019 г.

Методы исследования / Study methods

Лабораторное исследование включало определение антител классов IgA, IgM и IgG к кардиолипину, β₂-GP1, PS-PT. Для определения данных аФЛ на базе ООО «НПО «Диагностические системы» были разработаны экспериментальные наборы реагентов на основе непрямого двухстадийного иммуноферментного анализа (ИФА).

Валидация экспериментальных тестов для выявления разных типов аФЛ проведена на образцах сывороток крови от больных первичным и вторичным АФС (n = 70); с системными ревматоидными заболеваниями (n = 10); с инфекционными заболеваниями разной этиологии (n = 251); от беременных с патологией на фоне АФС (n = 10); содержащие ревматоидный фактор (n = 11); от доноров (случайная выборка, n = 201). Было проведено сравнение с коммерческими аналогами производства Orgentec Diagnostika GmbH (Германия), Euroimune AG (Германия), Innova Diagnostics Inc. (США). Калибраторы аттестованы относительно E.N. Harris стандарта (Louisville APL Diagnostics, США) и IgG Sapporo стандарта (HCAL, Werfen, Австралия) с использованием коллекции образцов, аттестованных в референс-тесте – Orgentec Diagnostika. Положительными считали результаты проведенного ИФА-теста на аФЛ при пороговом значении выше 99-го перцентиля для каждого из выявляемых маркеров АФС.

Использование тестирования на аD1-β₂-GP1 в качестве более специфичного маркера АФС затруднено низкой сходимостью результатов между существующими немногочисленными коммерческими наборами [8]. Так, несомненный интерес представляет поиск альтернативных эпитопов/доменов β₂-GP1 в качестве диагностически эффективных мишеней для детекции аутоантител. Предполагается, что сигнальный пептид P1, содержащий аФЛ-связывающий мотив и не присутствующий в зрелом β₂-GP1, способен вызывать аутоиммунные реакции. В работе P. de Moerloose с соавт. (2017) показано, что CD4+ Т-клетки были способны распознавать последовательность Р1 [13].

Для этой цели были изучены потенциальные антигенные эпитопы β₂-GP1, смоделированные с помощью рекомбинантных белков (n = 12) и синтетических пептидов (n = 3). Выбор и создание возможных иммунологически значимых областей β₂-GP1 проведены на основании данных, опубликованных в базах PubMed Национального центра биотехнологической информации США (англ. National Center for Biotechnology Information, NCBI) и GenBank NCBI. Для дальнейшей работы в качестве перспективных были отобраны 4 последовательности, оптимизированы условия проведения ИФА индивидуально для каждой из этих конструкций. Для верификации созданных конструкций, содержащих в своем составе последовательности белка β₂-GP1, были использованы: 34 образца сыворотки крови, содержащие аβ₂-GP1 (аттестованные как положительные в тестах Orgentec, Euroimune, Innova Diagnostics); 5 образцов, содержащих аD1-β₂-GP1 (аттестованные как положительные в тесте Innova Diagnostics); 46 образцов от доноров крови.

Этические аспекты / Ethical aspects

Все процедуры, выполненные в данном исследовании, соответствуют этическим стандартам Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. Клинический материал для исследования представлял собой не персонализированные остаточные образцы, полученные в ходе рутинного тестирования, или архивные образцы из банка образцов предприятия (ООО «НПО «Диагностические системы»). Добровольное информированное согласие от пациентов получено в начале лечебно-диагностического процесса по месту лечения.

Статистический анализ / Statistical alanalysis

Аккумулирование базы собранных клинических данных выполнялось с помощью электронной таблицы Microsoft Excel. Статистический анализ результатов был проведен с использованием пакетов программ Analyse-it 5/66 компании Analyse-it Software, Ltd. (Великобритания) для ряда параметров валидации экспериментальных тестов и SPSS Statistics 26.0 (англ. Statistical Package for the Social Sciences) производства IBM (США) для расчета частоты встречаемости отдельных типов аутоантител в группах сравнения (значение выраженно в процентном соотношении с расчетом стандартного отклонения). Достоверность различий между двумя парными выборками считали с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

Валидация экспериментальных тестов / Validation of experimental tests

Валидация экспериментальных тестов показала, что внутриплашечная, межплашечная, межсерийная воспроизводимость (повторяемость) каждого из наборов реагентов не превышала 8 %. Для сравнения использованы тесты производства Orgentec Diagnostika GmbH (Германия). Получена корреляция между тестами ООО «НПО «Диагностические системы» и Orgentec: для aCL разных классов получено значение R² = 0,92; для аβ₂-GP1 разных классов – R² = 0,95.

Оценка перекрестной реактивности с инфекционными заболеваниями показала отсутствие таковой при ВИЧ-инфекции, гепатитах В и С как для тестов на aCL, так и аβ₂-GP1. При сифилисе этот показатель составил 2,2 % (95 % доверительный интервал (ДИ) = 0,4–11,6 %), при COVID-19 – 1,7 % (95 % ДИ = 0,5–5,8 %) как для тестов на aCL, так и аβ₂-GP1.

Проведенные исследования по валидации данных наборов реагентов (в сравнении с референс-тестами; с использованием признанных международных стандартов; оценкой перекрестной реактивности на образцах, полученных от пациентов с соматическими, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями и т. д.) показали высокие аналитические характеристики тестов. Аналитическая чувствительность тестов не превышает 0,5 Ед/мл.

Альтернативные антигенные мишени для эффективной диагностики аβ₂-GP1 / Alternative antigenic targets for effective aβ₂-GP1diagnostics

В качестве альтернативной антигенной мишени для эффективной диагностики аβ₂-GP1 были рассмотрены отдельные эпитопы/домены β₂-GP1. Результаты оценки выбранных рекомбинантных белков и пептидов представлены в таблице 1.

Установлено, что максимальную диагностическую эффективность для определения аβ₂-GP1 имеют пептид Р1 (71,5 %) и рекомбинантный белок D1 (66аа) – 60,8 %. Полученные результаты требуют дальнейшего изучения диагностической значимости данных областей в ассоциации с клиническими проявлениями АФС. Кроме того, аФЛ-связывающие мотивы, присутствующие в пептидах, способны ингибировать активность аФЛ и могут обеспечить стратегию профилактики АФС в качестве альтернативы использованию антикоагулянтов [7].

Частота обнаружения аФЛ на разных стадиях COVID-19 / aPL detection frequency at different COVID-19 stages

Среди пациентов в острой фазе COVID-19 аФЛ выявлены у 81,7 % обследованных, что в 5 раз превысило аналогичный показатель среди контрольной группы (16,7 %) (t = 9,38; p < 0,001) (рис. 1). В стадию реконвалесценции отмечено достоверное снижение данного показателя (t = 2,10; p = 0,038), аФЛ выявлялись у 36–39 % переболевших на протяжении 9 мес после постановки диагноза.

В образцах сыворотки крови доноров контрольной группы отмечена одинаково низкая встречаемость отдельных маркеров АФС, не превышающая 1,7–3,3 %. В то же время у лиц, инфицированных SARS-CoV-2, профиль выявленных аФЛ и частота обнаружения отличались значительными колебаниями (табл. 2).

Среди всех выявляемых маркеров АФС у больных COVID-19 первое ранговое место по частоте обнаружения занимают IgG к β₂-GP1, кардиолипину и PS-PT (38,3, 35,0 и 33,3 % соответственно), на втором месте – aCL IgM (30,0 %), наименьшая встречаемость показана для IgA к PS-PT и β₂-GP1 (11,7 и 10,0% соответственно).

У реконвалесцентов COVID-19 исследование было проведено трижды с интервалами между сбором клинического материала в 2,5–3 мес, что позволило оценить изменения в профиле аФЛ, которые превалируют на разных сроках после постановки диагноза (рис. 2). В первые 6 мес лидирующие позиции занимали IgG к PS-PT и aCL IgM. На момент третьего сбора клинического материала у этих лиц резко начинали превалировать aCL IgG (30,0 % от всех выявленных маркеров), что можно рассматривать как отсроченные последствия перенесенной инфекции или влияние других факторов, не связанных с COVID-19.

Следует отметить, что аβ₂-GP1 IgM у больных не выявлены как в острой фазе COVID-19, так и в стадии реконвалесценции. IgM к PS-PT отсутствовали на ранних стадиях заболевания и появлялись только спустя 3,5 мес от постановки диагноза.

Таким образом, при проведении исследования по обнаружению аФЛ среди пациентов на различных стадиях COVID-19 нами была установлена значительная частота встречаемости данных аутоантител. У всех пациентов с диагнозом COVID-19 в острую стадию течения заболевания обнаружен, по крайней мере, один лабораторный маркер АФС: 10 (20,8 %) пациентов были с положительным результатом теста на 2 и более типов аФЛ и 12 (25,0 %) – на 3 и более типов антител. Около трети лиц с диагнозом COVID-19 имеют высокую вероятность возникновения тромбозов [4–6]. В нашем исследовании более половины положительных находок были связаны с двумя типами аФЛ: IgG к PS-PT и aCL IgM; доля больных с наличием антител к PS-PT и отсутствием других аФЛ составила 6,7 %. В ряде случаев состояние этих пациентов может рассматриваться как предшествующее развитию тромботических осложнений [9].

Динамический анализ позволил выявить изменения в спектре циркулирующих аФЛ в организме больного по мере развития заболевания. Большинство из этих вирус-ассоциированных aФЛ предположительно являются транзиторно позитивными и циркулируют кратковременно в организме больного. Вместе с тем клинические последствия их появления требуют дальнейшего изучения. Некоторые исследователи предполагают, что местная иммунная стимуляция вследствие вирусной инфекции может накладываться на ранее циркулирующие в организме человека аФЛ и таким образом приводить к тяжелому тромбовоспалительному поражению легких пациентов с COVID-19 [2][14].

Нами не установлено достоверных различий в частоте обнаружения каких-либо аФЛ в зависимости от тяжести COVID-19.

Заключение / Conclusion

Созданы рекомбинантные конструкции для определения различных типов аФЛ и альтернативных иммунологически значимых областей β₂-GP1. Оптимизированы условия проведения ИФА индивидуально для каждого вида определяемых аутоантител. Дизайн тестов, требования к образцам, метрологическая прослеживаемость соответствуют российским и международным стандартам, что позволяет рекомендовать данные тест-системы для использования в клинической лабораторной диагностике с целью выявления маркеров АФС.

Показано, что наравне с другими вирусными инфекциями COVID-19 является триггером выработки аФЛ. У 54,2 % лиц, инфицированных SARS-CoV-2, обнаруживался как минимум один тип аФЛ, у 45,8 % обследованных лиц были выявлены 2 и более лабораторных маркеров АФС. Вместе с тем некритериальные аФЛ, такие как антитела к PS-PT, могут быть более распространены, чем критериальные, поэтому следует рассмотреть вопрос включения их в скрининг лабораторных маркеров АФС у ковидных больных. Роль длительно циркулирующих вирус-ассоциированных aФЛ в развитии тяжелого тромбовоспалительного поражения у больных COVID-19 и особенно в постковидный период требует дальнейшего изучения.