Вклад внеклеточных ловушек нейтрофилов в протромботическое состояние и прогрессию опухоли у онкогинекологических пациенток

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Гиперкоагуляция сопутствует онкологическому процессу, прогрессии опухоли, метастазированию, увеличивает риск венозного тромбоза, который является второй по значимости причиной смерти у онкологических пациентов [1]. С другой стороны, тромбопрофилактика, профилактическое использование антикоагулянтов у онкологических пациентов имеет большой потенциал для снижения риска тромбоза, что приводит к улучшению выживаемости [2]. Однако использование антикоагулянтов остается серьезной проблемой из-за различий в частоте венозных тромбозов среди пациентов и высокого риска кровотечения, связанного с их применением [3]. Существует необходимость в углублении понимания патогенеза гиперкоагуляции у онкологических больных с целью разработки новых противотромботических стратегий.

Недавно было показано, что внеклеточные ловушки нейтрофилов (англ. neutrophil extracellular traps, NETs), генерируемые активированными нейтрофилами, состоящие из внеклеточной ДНК, гистонов, цитоплазматических белков и белков гранул нейтрофилов, являются участниками нового прокоагулянтного механизма и рассматриваются как связующее звено между процессами воспаления и тромбоза [4]. Внеклеточная ДНК в составе NETs способствует активации коагуляции через внутренний путь [5], а гистоны индуцируют активацию тромбоцитов и эритроцитов. Воспаление всегда сопутствует опухолевому процессу [6]. В одном из исследований было показано, что нейтрофилы усиливают синтез NETs на фоне опухолевого процесса у мышей и принимают непосредственное участие в тромбообразовании [7]. В другом исследовании на животных было продемонстрировано, что образование NETs сопутствует рак-ассоциированной дисфункции органов [8]. Таким образом, целью данного исследования явилась оценка прокоагулянтной активности NETs у онкогинекологических пациенток. Результаты подтвердили гипотезу о том, что опухолевый рост стимулирует нейтрофилы к высвобождению NETs у онкогинекологических пациенток, что в дальнейшем реализуется в активации коагуляции и может являться одним из факторов, обеспечивающих метастазирование.

Цель: оценка прокоагулянтной активности NETs у онкогинекологических пациенток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ / MATERIALS AND МETHODS

Дизайн исследования / Study design

В проспективном контролируемом интервенционном нерандомизированном исследовании, проведенном в период с апреля 2020 г. по октябрь 2022 г., приняли участие 120 женщин. Среди них было 87 пациенток в возрасте от 34 лет до 72 лет, госпитализированных с целью проведения планового оперативного лечения или курса химиотерапии в Университетской клинической больнице № 4 Сеченовского Университета и ФГБНУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского (основная группа), и 33 участницы в возрасте от 32 до 68 лет, которые были набраны из числа персонала стационаров (контрольная группа).

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения (основная группа): возраст старше 18 лет; диагноз при поступлении – злокачественные новообразования яичников, тела матки, шейки матки и молочных желез, подтвержденный данными инструментального, лабораторного и клинического обследования; подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения (контрольная группа): возраст старше 18 лет; без активного рака и онкологических заболеваний, тромбозов и тромбоэмболий, хронических воспалительных заболеваний в анамнезе; подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения (для обеих групп): возраст младше 18 лет; наличие активного инфекционного и/или воспалительного процесса; сердечно-сосудистые заболевания, тяжелое течение; сахарный диабет в стадии декомпенсации; хронические заболевания печени и почек в стадии обострения; другие сопутствующие онкологические заболевания; тромбоэмболические осложнения, сопутствующие коагулопатии и тромбоцитопатии; прием антикоагулянтов и антиагрегантов; тромботический или геморрагический синдром на момент обследования; отказ от участия в исследовании.

Группы обследованных / Patients groups

В основную группу вошли пациентки со злокачественными заболеваниями молочных желез и женских половых органов стадий I–III: рак тела матки (подгруппа 1; n = 18, из них на стадии 1 TNM (англ. tumor, nodus, metastasis) – 7 пациенток, на стадии 2 TNM – 5 пациенток, на стадии 3 TNM – 6 пациенток), рак яичников (подгруппа 2; n = 26, из них на стадии 1 TNM – 11 пациенток, на стадии 2 TNM – 5 пациенток, на стадии 3 TNM – 10 пациенток), рак шейки матки – аденокарцинома цервикального канала (подгруппа 3; n = 13; все на стадии 1 TNM), рак молочной железы (подгруппа 4; n = 30, из них на стадии 1 TNM – 9 пациенток, на стадии 2 TNM – 6 пациенток, на стадии 3 TNM – 7 пациенток, на стадии 4 TNM – 8 пациенток). В контрольную группу вошли 33 здоровые женщины.

Методы исследования / Study methods

Образцы плазмы получали путем венепункции у всех пациенток однократно при поступлении в отделение (до оперативного лечения, до назначения антикоагулянтов, до начала курса химиотерапии) и хранили при температуре –80° С после центрифугирования. Отбор проб крови натощак сухой стерильной иглой из локтевой вены производили в пластиковую пробирку с антикоагулянтом в соотношении 9:1. Раствор 3,8 % трехзамещенного цитрата натрия использовали в качестве антикоагулянта.

Определение маркеров нетоза / Assessing NETosis markers

Для определения концентрации в плазме крови антигена миелопероксидазы человека (MПO:Aг) использовали набор для иммуноферментного анализа (ИФА) Hycult Biotech (Нидерланды), в соответствии с которым нормальный референтный уровень МПО:Аг составляет 2,56 ± 0,33 нг/мл.

Определение в плазме крови цитруллинированного гистона H3 (англ. citrullinated histone H3, citH3) выполняли с помощью набора для ИФА Citrullinated Histone H3 ELISA Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, США).

Определение маркеров тромбинемии и фибринообразования / Assessing markers of thrombinemia and fibrin formation

Определение маркеров тромбинемии – комплексов тромбин–антитромбин (ТАТ) проводили иммуноферментным способом с помощью набора Siemens Healthineers Enzygnost^TM ТАТ MicroKit (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Германия) иммуноферментным способом на спектрофотометре Boehnringer ELISA-Photometr (Boehnringer, Германия).

Содержание D-димера измеряли с помощью коммерческого иммуноанализа (TECHNOLEIA^®, Австрия, реагент Techoclone). Концентрацию D-димера > 250 нг/мл считали патологической в соответствии с данными производителя.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проводили с учетом требований Хельсинской декларации. Пациентки после получения исчерпывающей информации подписывали информированное согласие.

Статистический анализ / Statistical analysis

Обработку данных осуществляли с использованием специализированного программного обеспечения Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., США).

Статистическая обработка данных включала в себя расчёт описательных статистик: средней арифметической (M), среднеквадратического отклонения (SD), минимального и максимального значений лабораторных показателей.

Оценка на нормальность распределения проводилась при помощи теста Харке–Бера (Jarque–Bera test). Нулевая гипотеза H₀ о том, что остатки значений рассматриваемых показателей групп участников имеют нормальное распределение, была нами отклонена на уровне значимости p ≤ 0,05.

Непараметрическая оценка и сравнение значений показателей между группами пациенток была проведена при помощи критерия Манна–Уитни для несвязанных выборок (Mann–Whitney U-test). Нулевая гипотеза H₀ была сформулирована нами как отсутствие различий между группами пациенток. H₀ отклонялась во всех случаях при уровнях значимости p ≤ 0,05.

При изучении связей между переменными с точки зрения отражения соответствующих причинно-следственных отношений между значениями МПО:Aг и citН3 проводили расчет ρ – коэффициента ранговой корреляции Спирмена (англ. Spearman Rank Order Correlations) с фиксацией уровня значимости коэффициента в корреляционной матрице на уровне значимости p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Клинико-анамнестическая характеристика обследованных / Сlinical and anamnestic characteristic

Клинико-анамнестические данные обследованных участниц исследования представлены в таблице 1.

Интенсивность нетоза у онкогинекологических пациенток / NETosis intensity in oncogynecological patients

Для оценки интенсивности нетоза у онкогинекологических пациенток определяли концентрации его маркеров – МПО:Аг и сitH3. Было показано, что содержание обоих маркеров было значительно выше у онкологических пациенток, чем у здоровых лиц (табл. 1, рис. 1, 2).

Активация гемостаза у онкогинекологических пациенток / Hemostasis activation in oncogynecological patients

При анализе уровней D-димера и ТАТ у онкогинекологических пациенток выявлено их достоверное повышение в сравнении с контрольной группой и нарастание показателей с ростом стадии по TNM (рис. 3, 4).

При последующем корреляционом анализе выявлена достоверная кореляция повышения концентрации комплексов ТАТ от концентрации citH3 и МПО:Аг (табл. 2, 3).

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

Гиперкоагуляция значительно увеличивает летальность у онкологических больных [9]. О взаимосвязи между раком и тромбозом известно еще со времен Армана Труссо, который описал взаимосвязь идиопатического венозного тромбоэмболизма с латентными опухолями. В недавних исследованиях было показано, что NETs участвуют в активации свертывания, способствуют инициации и прогрессированию тромбоза. Помимо этого, активно изучается вклад NETs в прогрессию опухоли и метастазирование.

Впервые NETs были описаны в 2004 г. [10]. NETs высвобождаются из активированных нейтрофилов в процессе нетоза, который первоначально был признан защитным механизмом для организма хозяина. NETs являются производными активированных нейтрофилов и состоят из нитей ДНК и гистонов, которые захватывают и удерживают различные патогены до их уничтожения с помощью белков-ферментов, входящих в состав NETs [11].

Однако впоследствии нетоз стали определять и при асептическом воспалении [4][12][13]. Была продемонстрирована роль NETs в таких аутоиммунных заболеваниях, как псориаз, системная красная волчанка и ревматоидный артрит [14–16]. NETs также принимают участие в патогенезе тромбоза при сахарном диабете, атеросклерозе и васкулитах [17–19].

NETs различными путями оказывают влияние на систему гемостаза, участвуя в создании прокоагулянтного состояния, нарушая работу антикоагулянтов и фибринолиз [20]. При стимуляции нейтрофилов мышей с раком молочной железы и хроническим миеломным лейкозом повышался синтез NETs с последующей активацией гемостаза [21].

Многочисленные механизмы влияния NETs суммированы в таблице 4.

В настоящем исследовании продемонстрирована роль NETs в активации системы свертывания у онкогинекологических пациенток с опухолями тела матки, шейки матки, яичников и молочной железы. В исследовании были оценены концентрации маркеров нетоза, таких как концентрации МПО:Аг и citН3 у онкогинекологических пациенток с различными источниками опухолей на разных стадиях заболевания. Одномоментно исследовали содержание D-димера и комплексов ТАТ. В нашем исследовании отмечено повышенное формирование NETs, а именно, достоверное повышение концентрации маркеров нетоза МПО:АГ и citH3 у онкологических пациентов, в большей степени на поздних стадиях TNM. Эти данные косвенно свидетельствуют о том, что повышение опухолевой нагрузки вызывает усиленное образование NETs. Параллельно повышению маркеров нетоза в зависимости от стадии заболевания происходило и нарастание концентрации маркеров активации гемостаза (D-димера и комплексов ТАТ). Выявлена достоверная корреляция между уровнем ТАТ от содержанием citH3 и МПО:Аг.

Роль NETs в процессе опухолевого роста в последние годы активно изучается. Доказано, что клетки-участницы воспалительной реакции и медиаторы воспаления способствуют индукции, росту опухоли и метастазированию [36]. Некоторые компоненты NETs оказывают цитотоксическое действие. Например, MПO повреждает клетки меланомы. При дефиците МПО у пациентов выше риск прогрессии опухоли и рецидивов [37]. Гистоны NETs разъедают сосудистую сеть опухоли, разрушают эпителиальные клетки и способствуют лизису клеток опухоли [7][38]. При этом протеазы NETs способны разрушать внеклеточный матрикс, запуская метастазирование. Выделяемая NETs матриксная металлопротеиназа 9 (англ. matrix metalloproteinase 9, ММР-9) блокирует апоптоз клеток опухоли и обеспечивает миграцию, инвазию и метастазирование, например, при раке легкого [39–41]. В одном из исследований NETs у пациентов с саркомой Юинга в опухолевой ткани были выявлены нейтрофилы, активно выделяющие NETs. При этом нейтрофилы и NETs определялись преимущественно у пациентов на поздних стадиях с метастазами. Болезнь быстро рецидивировала у пациентов с полной ремиссией после химиотерапии [42].

NETs, связываясь с опухолевыми клетками, облегчают им процесс метастазирования, связывая опухолевую клетку и эндотелий в органе-мишени метастаза. На животных моделях показано, что после фиксации NETs к эндотелию сосудов они начинают захват опухолевых клеток нитями ДНК из кровотока. Таким образом, формирование NETs, прогрессия опухоли, метастазирование могут формировать порочный круг у онкологических пациентов. Вышеописанный механизм дает возможность рассматривать NETs в качестве одного из участников процесса метастазирования, а значит, и как возможную мишень для потенциальной терапии. Предотвратить влияние NETs на прогрессию опухоли потенциально возможно введением ингибиторов эластаз или ДНКаз [43].

В данном исследовании параллельно изучению уровней маркеров нетоза проводилась оценка содержания маркеров активации гемостаза, а именно, ТАТ и D-димера, при этом у всех пациенток выявлена достоверная активация гемостаза. Однако при проведении корреляционного анализа достоверная корреляция была установлена лишь между значениями комплексов ТАТ и маркерами нетоза.

В исследованиях на животных моделях рака были выявлены повышенная инфильтрация нейтрофилами тканей различных органов, сосудистые повреждения и тромбоцитарно-нейтрофильные комплексы как результат массивного нетоза. Введение ДНКазы давало положительный эффект в регрессе этих состояний, что еще раз подтверждает вклад нетоза в развитие при раке полиорганной недостаточности [8]. Исследования, не так давно проведенные на животных, показали, что подавление нетоза снижает активность нарастания протромботического состояния и метастазирования [7][8][43].

Таким образом, NETs являются одними из основных игроков в запуске тромбообразования при раке. Соответственно, NETs могут выступать в роли мищени для разработки новых подходов к тромбопрофилактике [44]. Определение маркеров нетоза является потенциальным скринингом начальных нарушений в системе гемостаза в тех ситуациях, когда основные тесты лабораторной оценки еще не изменены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что опухолевая ткань создает условия, стимулирующие нейтрофилы к высвобождению прокоагулянтных внеклеточных ловушек, которые, в свою очередь не только способствуют созданию прокоагулянтного состояния, но также и являются одним из факторов, обеспечивающих метастазирование. Разработка терапии, направленной на NETs, потенциально способна оказать влияние на систему гемостаза у онкологических пациентов и снизить интенсивность процессов метастазирования.