Внеклеточные ловушки нейтрофилов как маркеры тромбовоспаления в патогенезе злокачественных новообразований женских половых органов и молочной железы

Введение / Introduction

Нейтрофилы, наряду с дендритными клетками и макрофагами, подобно фагоцитам являются важным компонентом врожденного иммунитета [1]. С вовлечением различных имеющихся в их арсенале механизмов они отражают угрозу со стороны различных патогенов, в том числе бактерий, грибов, простейших, вирусов, антител и иммунных комплексов, цитокинов и хемокинов – интерлейкин-8 (англ. interleukin-8, IL-8), фактор некроза опухоли (англ. tumor necrosis factor, TNF) и др. [2]. Нейтрофилы подвергаются специализированному процессу запрограммированной гибели (без активации каспаз в процессе апоптоза), что приводит к деконденсации хроматина с образованием сетей – внеклеточных ловушек нейтрофилов (англ. neutrophil extracellular traps, NETs).

Впервые NETs были выявлены в 2004 г. [3][4]. NETs состоят из нитей деконцентированной ДНК и множества белковых/ферментных компонентов и химических веществ, в том числе миелопероксидазы (англ. myeloperoxidase, МРО), эластазы нейтрофилов, тканевого фактора [5]. Миелопероксидаза представляет собой пероксидазу, которая использует гем в качестве кофактора и производит хлорноватистую кислоту (HOCl) из перекиси водорода (H2O2) и аниона хлора (Cl^–) во время окислительного взрыва нейтрофилов [6]. Нейтрофильная эластаза гидролизует белки внутри специализированных нейтрофильных лизосом, известных как азурофильные гранулы, и разрушает как белок А наружной мембраны, так и факторы вирулентности бактерий [7]. Нейтрофильная эластаза в составе NETs также может разрушать внеклеточный матрикс в тканях организма человека, в состав которого входят коллаген IV и эластин.

Одним из ключевых этапов образования NETs является цитруллинирование гистонов, осуществляемое гистон-специфическим ферментом пептидиларгининдезиминазой 4 (англ. peptidylarginine deiminase type 4, PAD4). Новые данные указывают на то, что цитруллинированный гистон H3 (англ. citrullinated histone H3, citН3), ключевой компонент NETs, может быть признан специфическим маркером нетоза [8] как в образцах тканей, так и в периферической крови [9]. Гиперцитруллинирование гистонов является важным этапом в формировании NETs, а citH3 считается новым и специфическим биомаркером этого процесса. Губительное действие NETs в отношении патогенов обусловлено окислением под влиянием MPO и HOCl и расщеплением нейтрофильной эластазой. Мощные поливалентные эффекты NETs не являются специфическими, дисрегуляция процессов нетоза на фоне острого и хронического воспаления приводит к повреждению тканей, фиброзу, гиперкоагуляции, тромбозу, атеросклерозу, прогрессии опухоли и метастированию [5][10–12]. Образование NETs приводит к локальному тромбозу, по-видимому, направленному изначально на предотвращение распространения патогенов. Кроме того, было показано, что NETs повышают интенсивность фиброза в различных тканях, в частности в легких, и что фиброз легких индуцируется NETs и зависит от PAD4 [13].

Одним из самых частых осложнений и основных причин смертности онкологических больных является рак-ассоциированный тромбоз. Риск первичной венозной тромбоэмболии (ВТЭ) при раке повышен в 4–7 раз, рецидива ВТЭ – в 3 раза, кровотечения, связанного с антикоагулянтами – в 2 раза, смерти от ВТЭ – в 7–10 раз и артериальной тромбоэмболии – в 2 раза по сравнению с пациентами без опухолевых заболеваний [14][15]. Факторы риска тромбоза, связанного с раком, могут быть связаны с пациентом (этническая принадлежность, возраст, сопутствующие заболевания и т. д.), с опухолью (гистологический тип, степень, первичная локализация и время после установления диагноза и т. д.), с лечением (химиотерапия, хирургическое вмешательство/госпитализация, антиангиогенные препараты, центральные венозные катетеры, стимуляторы эритропоэтина и т. д.), а также с важными биомаркерами (количество лейкоцитов и тромбоцитов, содержание D-димера и гемоглобина и т. д.) [16]. Недавними исследования было показано, что NETs обладают поливалентными прокоагуляционными свойствами, обеспечивая «скелетную» поддержку молекул прокоагулянтов в ассоциации с эритроцитами и тромбоцитами, что способствует тромбозу in vitro и in vivo. NETs содержат сложные белковые компоненты, которые могут активировать эндогенный путь коагуляции, способствуя тромбообразованию. Таким образом, было доказано, что NETs являются важными участниками тромбообразования у онкологических больных [17][18].

В настоящее время активно исследуется роль NETs в инициации, формировании и метастазировании рака, а также в тромбозах, связанных с раком. Оказалось, что опухоль может индуцировать нетоз на фоне создания гипоксической микросреды в связи с более высокой экспрессией фактора транскрипции HIF-1α (гипоксией индуцируемый фактор-Iα; англ. hypoxia-inducible factor-Iα), активных форм кислорода при выраженном окислительном стрессе. Также секретируемые опухолью цитокины, протеазы и экзосомы запускают нетоз [19]. Гипоксическая микросреда и окислительный стресс, которые способствуют секреции трансформирующего фактора роста-β1 (англ. transforming growth factor-β1, TGF-β1), являются ключевыми индукторами эндотелиально-мезенхимального перехода (ЭMП). TGF-β играет существенную роль в процессе ЭМП в микроокружении опухоли во время онкогенеза и метастазирования. Было показано, что NETs стимулируют ЭМП для облегчения онкогенеза [20][21], роста [22] и метастазирования [22][23]. Следовательно, NETs могут способствовать росту и прогрессированию опухоли, накапливаясь в микроокружении опухоли [24]. NETs способствуют распространению опухоли на большие расстояния, защищая опухолевые клетки и препятствуя атаке циркулирующих цитотоксических лимфоцитов [25]. Связанная с NETs нейтрофильная эластаза, матриксная металлопротеиназа 9 и катепсин G разрушают межклеточное соединение и базальную мембрану путем протеолиза VE-кадгерина, тем самым увеличивая проницаемость эндотелиальных клеток. Этот процесс также активирует эндотелиальные клетки для рекрутирования циркулирующих опухолевых клеток, которые захватываются NETs, чтобы способствовать метастазированию рака [21].

В первом в мире исследовании NETs изучались в опухолевой ткани у пациентов с саркомой Юинга. Опухоль-ассоциированные NETs были выявлены у пациентов с неблагоприятным прогнозом [26]. Кроме того, NETs были обнаружены в тканях опухолей толстой кишки и метастатических лимфатических узлах. От центра опухоли к ее дистальному краю содержание NETs постепенно снижается [27]. Исследование показало, что концентрация NETs в образцах ткани лимфомы положительно коррелирует с концентрацией их в плазме крови. Высокий уровень NETs коррелировал с плохой выживаемостью. Еще одно исследование показало, что повышенный уровень циркулирующих NETs в послеоперационном периоде у пациентов после резекции печени по поводу метастатического колоректального рака был связан со снижением безрецидивной выживаемости [28]. У пациентов с первичной карциномой печени в сочетании с неалкогольным стеатогепатитом концентрация NETs была выше, чем у пациентов со здоровой печенью или доброкачественными заболеваниями печени [29].

Цель: оценка активности нетоза (процесса синтеза внеклеточных ловушек нейтрофилов), а именно, концентрации citН3 как маркера нетоза в плазме крови пациенток со злокачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

С сентября 2019 г. по март 2022 г. на базе ГБУЗ ГКОБ № 1 ДЗМ, а также на базе ФГБНУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского проведено проспективное контролируемое наблюдательное нерандомизированное исследование с участием 78 пациенток в возрасте от 30 до 72 лет, госпитализированных в стационар для планового оперативного лечения.

Группы обследованных пациенток / Groups of patients examined

В основную группу вошли 45 пациенток со злокачественными новообразованиями половых органов и молочных желез I–III стадий: рак яичников (n = 13), рак тела матки (n = 15), рак шейки матки (аденокарцинома цервикального канала, n = 5) и рак молочных желез (n = 13).

Контрольную группу составили 33 женщины с доброкачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в основную группу: наличие злокачественного новообразования яичников, тела матки, шейки матки и молочных желез, подтвержденное данными клинического и инструментального обследования; добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: наличие доброкачественных новообразований женских половых органов и молочной железы; отсутствие в анамнезе активного рака и онкологических заболеваний, тромбозов и тромбоэмболий, хронических воспалительных заболеваний; добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: наличие активного инфекционного и/или воспалительного процесса; аллергическая реакция на контрастные вещества; применение антикоагулянтов, препаратов химиотерапии; признаки тромботического или геморрагического синдрома на момент первого обследования.

Методы исследования / Study methods

Отбор проб крови производили натощак за сутки до операции сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия.

Гиперцитруллинирование гистонов является важным этапом в формировании NETs, а citH3 считается новым и специфическим биомаркером этого процесса. Определение уровня citH3 в плазме крови пациенток основной и контрольной групп осуществляли с использованием иммуноферментного анализа (Citrullinated Histone H3 ELISA Kit, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, США).

Определение концентрации D-димера выполняли методом латекс-теста Dimertest (Agen, Австралия), основанного на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер является одним из наиболее специфических тестов для диагностики ДВС-синдрома, наличия тромбофилии и тромботических осложнений, позволяет выявить интенсивность полимеризации фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови. Общий анализ крови и измерение значений С-реактивного белка (СРБ) проводили с использованием рутинных методик из венозной крови.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проводилось согласно требованиям Хельсинской декларации Всемирной медицинской организации. Все пациентки получили исчерпывающую информацию и подписали форму информированного согласия.

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистический анализ проводили посредством программного обеспечения IBM SPSS Statistics версии 25 с использованием в анализе непараметрических критериев Манна–Уитни, Краскела–Уоллиса, доверительных интервалов и апостериорного критерия Даннета. Статистически значимые различия оценивали в случае достижения достоверного уровня значимости (р < 0,05), а также в случае различий между границами доверительных интервалов в сравниваемых группах. Для анализа связи между переменными, выраженными в количественной размерности, использовали корреляционно-регрессионный анализ. На этапе корреляционного анализа применяли непараметрический критерий Спирмена (связь считается слабой при значении коэффициента корреляции до 0,3, средней – от 0,3 до 0,7 и высокой – свыше 0,7). Использование непараметрической статистики связано с отсутствием нормальности в распределении переменных.

Результаты / Results

Клинико-анамнестическая характеристика обследованных пациенток / Clinical and anamnestic characteristics of patients examined

Клинико-анамнестические данные обследованных женщин представлены в таблице 1. Пациентки основной и контрольной групп достоверно не различались по возрасту и индексу массы тела. Обращает на себя внимание большое количество пациенток с ожирением как в основной, так и в контрольной группе, особенно среди женщин с доброкачественными и злокачественными заболеваниями молочных желез и эндометрия. В основной группе было существенно повышено количество пациенток с анемией, особенно в подгруппах рака эндометрия и рака яичников.

В таблице 2 представлены результаты изученных лабораторных показателей обследованных пациенток. Выявлены значимые различия (р < 0,05) между основной и контрольной группой в отношении таких показателей, как содержание D-димера (1,635 мкг/мл и 0,379 мкг/мл) и citH3 (1,746 нг/мл и 0,326 нг/мл), отношение нейтрофилы/лимфоциты (6,1 и 1,914), число тромбоцитов (255,2×10⁹/л и 190,2×10⁹/л) и концентрация С-реактивного белка (3,779 мг/дл и 0,207 мг/дл), соответственно.

Для поиска различий в концентрациях citH3 в основной и контрольной группах использован непараметрический критерий Манна–Уитни, при этом продемонстрирована высокая степень значимости различий (р = 0,0001). У 95 % пациенток основной группы содержание citH3 в плазме крови колебалось от 1,434 до 2,058 нг/мл, у 95 % пациенток контрольной группы – от 0,281 до 0,371 нг/мл при использовании доверительного интервала (рис. 1).

Для выявления различий в концентрации citH3 среди онкологических пациенток с различными источниками опухоли использован непараметрический критерий Краскела–Уоллиса, анализ доверительных интервалов и апостериорный критерий Даннета. Установлено, что значения citН3 у пациенток с опухолями тела и шейки матки колебались от 2,271 до 2,992 нг/мл, у пациенток с опухолями яичника – от 1,357 до 2,123 нг/мл, у пациенток с опухолями молочной железы – от 0,331 до 0,859 нг/мл. Таким образом, содержание citН у пациенток с опухолями тела и шейки матки, а также с опухолями яичников оказалось достоверно выше, чем у пациенток контрольной группы, при этом концентрация у пациенток с опухолями молочной железы значимо не отличалась от контрольной группы (рис. 2, табл. 3).

Оценку взаимосвязей между значениями citН3, СРБ, D-димера как маркера активации гемостаза, количеством нейтрофилов и тромбоцитов и соотношением нейтрофилы/лимфоциты у всех обследованных пациенток проводили с использованием корреляционно-регрессионного анализа и непараметрического критерия Спирмена. В результате была получена значимая (р = 0,0001) степень корреляции всех независимых переменных (СРБ, D-димера, нейтрофилов, тромбоцитов и соотношения нейтрофилы/лимфоциты) с концентрацией citН3. Коэффициент корреляции во всех случаях достигал среднего уровня (от 0,3 до 0,7) за исключением корреляции между концентрациями citН3 и СРБ, которая являлась самой высокой и достигала 0,75. Как можно видеть (рис. 3), значение citН3 практически линейно возрастало до значения 2 нг/мл при одновременном росте СРБ до уровня от 5 до 6 мг/дл. Далее увеличение концентрации citН3 не сопровождалось увеличением концентрации СРБ.

Рост числа тромбоцитов прослеживался равномерно при росте значений citН3. При минимальных концентрациях citН3 число тромбоцитов не превышало 250×10⁹/л, при росте концентрации citН3 до 4 нг/мл линейно возрастало количество тромбоцитов от 250×10⁹/л до 350×10⁹/л (рис. 4).

В процессе изучения полученных данных проведено сравнение количества тромбоцитов в крови всех обследованных пациенток с использованием критерия Манна–Уитни и доверительного интервала. В результате установлено, что между группами существуют значимые различия с высоким уровнем значимости (р = 0,0001). Анализ доверительного интервала показал, что количество тромбоцитов в контрольной группе колебалось от 178,14 до 202,35×10⁹/л, в группе больных – от 236,68 до 273,77×10⁹/л (рис. 5).

Обсуждение / Discussion

Недавние результаты многочисленных исследований позволяют нам рассматривать нейтрофилы как потенциальных ключевых игроков в неопластических процессах в дополнение к их роли в защите хозяина от инфекции. При этом некоторые данные убедительно свидетельствуют о том, что нейтрофилы могут играть роль в прогрессии опухоли и рак-ассоциированном тромбозе, катастрофическую для хозяина. К сожалению, в настоящее время не разработана эффективная терапия, направленная на нейтрофилы в контексте прогрессии опухоли и тромботических рисков. Однако по мере того, как наше понимание проонкогенных и протромбогенных механизмов нейтрофилов улучшается, появляется возможность разработки новых мишеней противоопухолевой терапии и улучшения исходов у пациентов.

Как показали исследования, NETs способствуют пролиферации опухоли [30], метастазированию [31] и тромбозу [32]. В предыдущих исследованиях сообщалось об обнаружении NETs в плазме крови при различных заболеваниях, таких как аутоиммунный васкулит мелких сосудов, колоректальный рак и гепатоцеллюлярный рак [28][29][33]. В проведенном нами исследовании впервые был оценен вклад нетоза в течение опухолевого процесса при опухолях тела и шейки (аденокарцинома) матки, яичников, а также молочных желез. Концентрация citH3, маркера нетоза, у пациентов с опухолями тела и шейки матки, а также яичников оказались выше, чем у пациентов с доброкачественными заболеваниями, что позволяет предположить, что нейтрофилы и высвобождаемые NETs играют важную роль в развитии опухолей этой локализации.

Лейкоцитоз характерен для онкологических больных. При опухолевом процессе лейкоцитоз представлен преимущественно зрелыми нейтрофилами. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ), продуцируемый опухолевой тканью, повышает количество нейтрофилов и усиливает их активацию. Повышенное содержание нейтрофилов у онкологических больных сочетается с неблагоприятным прогнозом течения заболевания. В эксперименте введение ГКСФ здоровым мышам приводило к гиперцитруллинизации гистона H3 в нейтрофилах и повышению интенсивности нетоза. Введение ГКСФ мышам с опухолями молочной железы приводило к повышению концентрации NETs, укорочению времени кровотечения и микротромбообразованию в почках и легких. Фрагменты нейтрофильных ловушек запускают активацию и агрегацию тромбоцитов, формирование эритроцитарных тромбов, выделение фактора фон Виллебранда [34][35]. В нашем исследовании было показано, что концентрация citH3 значительно коррелирует с количеством нейтрофилов и соотношением нейтрофилы/лимфоциты, что подтверждает роль нейтрофилов как основных источников NETs и роль нетоза в опухолевом росте.

Системный воспалительный ответ характеризуется увеличением концентрации циркулирующих белков острой фазы, в частности, СРБ. Было показано, что до операции этот показатель является независимым от стадии заболевания прогностическим фактором при многих типах рака [36]. Клетки-участники системного воспалительного ответа, такие как нейтрофилы, лимфоциты, моноциты и тромбоциты, имеют прогностическое значение у пациентов со злокачественными новообразованиями [37]. Предоперационные изменения циркулирующих лейкоцитов и, в частности, соотношение нейтрофилов и лимфоцитов использовались для прогнозирования общей и опухоль ассоциированной выживаемости при многочисленных злокачественных опухолях [38]. В проведенном исследовании помимо взаимосвязи опухолевого процесса и повышенной концентрации маркера нетоза было показано также, что повышение содержания citH3 достоверно коррелировало с увеличением концентрации СРБ.

О связи между раком и тромбозом известно еще со времен Армана Труссо, описавшего взаимосвязь между идиопатическим венозным тромбоэмболизмом и латентным опухолевым ростом. Тромбоз является одним из важных осложнений онкологического процесса, находясь на втором месте среди всех причин смерти у онкологических больных. Некоторые исследования показали, что NETs выступают в качестве строительного материала, и путем стимуляции агрегации тромбоцитов они участвуют в формировании тромбов при раке [35]. На моделях рака молочной железы отмечено увеличение количества нейтрофилов на фоне роста опухоли. На более поздних стадиях заболевания, когда уровни свободно циркулирующей ДНК в плазме крови (как составной части NETs) и citH3 начинают определяться в плазме крови, манифестируют первые тромбозы.

Тромбоцитоз традиционно сопутствует паранеопластическому процессу. Во многих исследованиях доказано, что тромбоцитоз выступает в роли предиктора отдаленных метастазов, в частности колоректального рака [39]. Некоторые типы опухолевых клеток, в частности опухолей яичников, способны производить тромбопоэтин – цитокин, стимулирующий дифференцировку и пролиферацию мегакариоцитов и, как следствие, продукцию тромбоцитов. В проведенном нами исследовании было достоверно показано увеличение количества тромбоцитов у пациенток с опухолями яичников, тела и шейки матки, а также молочной железы по сравнению с женщинами с доброкачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы. Кроме этого, была выявлена значимая связь между увеличением количества тромбоцитов и концентрацией citH3 у онкологических пациенток, что свидетельствует о параллельно протекающих процессах воспаления и тромбообразования. Значимая корреляция также выявлена между повышением концентрации гистона citH3 и уровнем D-димера, как одного из главных маркеров тромбообразования, свидетельствующего о наличии протромботического состояния.

Учитывая вышеизложенное, NETs можно рассматривать как один из протромбогенных факторов у онкологических пациентов и возможную мишень для разработки новых вариантов тромбопрофилактики и антитромботической терапии. Кроме этого, определение маркеров нетоза может являться скринингом начала нарушений в системе гемостаза в ситуациях, когда основные рутинные тесты еще не изменены, а также маркером неблагоприятного прогноза развития заболевания.

Заключение / Conclusion

В представленном исследовании впервые проведена оценка выраженности процессов нетоза у пациенток с опухолями тела и шейки (аденокациномы) матки, яичников и молочных желез. В результате анализа полученных данных было показано, что у онкологических больных содержание citН3 существенно повышено и составляет от 1,434 до 2,058 нг/мл, что превышает концентрацию citН3 у женщин с доброкачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы, которое составляет от 0,281 до 0,371 нг/мл. Уровень citН3 у больных с опухолями тела и шейки матки колеблется от 2,271 до 2,992 нг/мл, у больных с опухолями яичников – от 1,357 до 2,123 нг/мл, у больных с опухолями молочной железы – от 0,331 до 0,859 нг/мл. Настоящее исследование не установило существенных различий в уровне citН3 у больных с опухолями молочной железы по сравнению с женщинами с доброкачественными новообразованиями молочной железы. При повышении концентрации citH3 значимо повышаются значения таких показателей как СРБ, D-димер, число нейтрофилов и тромбоцитов и соотношение нейтрофилы/лимфоциты. Выявлены существенные различия в количестве тромбоцитов в основной группе (236,68–273,77×10⁹/л) по сравнению с контрольной группой (178,14–202,35×10⁹/л).

Настоящее исследование демонстрирует лишь часть общей картины показателей, характеризующих взаимосвязь между процессами тромбовоспаления и опухолевого роста, отличающихся сложностью и многомерностью взаимосвязей. Вскрытие этих взаимосвязей способно привести к значительному прогрессу в вопросах патогенеза и диагностики.