РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩИЙ ГОРМОН ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ТЕРАПИИ БЕСПЛОДИЯ: ПОЛУЧЕНИЕ ЛИНИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ

Цель исследования: получение линии клеток, секретирующих максимальные количества лютеинизирующего гормона человека (ЛГ) в форме гетеродимера при отсутствии значимых количеств свободной альфа-субъединицы гормона.

Материалы и методы. Для согласованной экспрессии генов субъединиц ЛГ человека в клетках яичника китайского хомячка использовали пару оригинальных плазмид семейства p1.1, содержащих протяженные некодирующие области гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка и фрагмент конкатемера длинного концевого повтора вируса Эпштейна-Барр. Области открытых рамок считывания генов субъединиц ЛГ клонировали в векторы с генами дигидрофолатредуктазы (DHFR) или глутаминсинтазы (GS), трансфицировали в клетки, амплифицировали под действием метотрексата и получали клональные линии-продуценты методом предельных разведений.

Результаты. Для пары плазмид, в которой ген альфа-субъединицы связан с GS, а ген бета-субъединицы – с DHFR, удельная продуктивность первичной стабильно трансфицированной популяции клеток составила 0,1 пг/клетка/день при времени деления клеток 37 часов, а для обратной пары плазмид – 0,3 пг/клетка/день и 48 часов. Для первой популяции клеток и для полученных из нее клональных линий была проведена амплификация генетических кассет в геноме клеток под действием возрастающих концентраций метотрексата. Для поликлональной популяции было зафиксировано возрастание продуктивности клеток до 2,2 мкг/10⁶ клеток по достижении концентрации метотрексата 8 мкМ; для клональных линий клеток многократное возрастание продуктивности до значения 0,09 мкг/10⁶ клеток было зафиксировано только для одной линии из шести после одного шага амплификации.

Заключение. Потенциально промышленно пригодные клеточные линии, секретирующие значительные количества гетеродимерного ЛГ без значимой примеси свободной субъединицы, могут быть получены при помощи пары плазмидных векторов, кодирующих гены субъединиц ЛГ и селекционные маркеры DHFR или GS. Ко-трансфекция плазмид и последующая их амплификация в геноме клеток-продуцентов под действием метотрексата позволяет многократно увеличить уровень биосинтеза обеих субъединиц ЛГ.

1. Munoz E., Bosch E., Fernandez I., Portela S., Ortiz G., Remohi J., Pellicer A. The role of LH in ovarian stimulation. Curr Pharm Biotechnol. 2012; 13 (3): 409-16.

2. Leao Rde B., Esteves S.C. Gonadotropin therapy in assisted reproduction: an evolutionary perspective from biologics to biotech. Clinics (Sao Paulo). 2014; 69 (4): 279-93.

3. Ata B., Seli E. Strategies for Controlled Ovarian Stimulation in the Setting of Ovarian Aging. Semin Reprod Med. 2015; 33 (6): 436-48.

4. Bleau N., Agdi M., Son W., Tan S., Dahan M.H. A Comparison of Outcomes from In Vitro Fertilization Cycles Stimulated with Follicle Stimulating Hormone Plus either Recombinant Luteinizing Hormone or Human Menopausal Gonadotropins in Subjects Treated with Long Gonadotropin Releasing Hormone Agonist Protocols. Int J Fertil Steril. 2017; 11 (2): 79-84.

5. Mullen M.P., Cooke D., Crow M. Structural and functional roles of FSH and LH as glycoproteins regulating reproduction in mammalian species. In: Gonadotropin [Ed. J. Vizcarra]. Chapter 8. InTech: International Publisher. 2013: 155-80.

6. Воробьев И.И., Орлова Н.А., Ковнир С.В., Ходак Ю.А. Плазмида для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, плазмида для экспрессии в клетках СНО бета-субъединицы рекомбинантного ФСГ человека, клетка СНО – продуцент рекомбинантного ФСГ человека и способ получения указанного гормона. Патент РФ № 2560596. 2015; Бюл. № 23. URL: http://www.findpatent.ru/patent/256/2560596.html [Дата доступа: 20.05.2017].

7. OrlovaN.A., KovnirS.V., HodakJ.A., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Skryabin K.G. Improved elongation factor-1 alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 2014; 14: 56.

8. B ochkov Y.A., Palmenberg A.C. Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location. Biotechniques. 2006; 41 (3): 283-284, 286, 288 passim.

9. Almo S.C., Love J.D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 2014; 26: 39-43.

10. J azayeri S.H., Amiri-Yekta A., Gourabi H., Abd Emami B., Halfinezhad Z., Abolghasemi S. et al. Comparative Assessment on the Expression Level of Recombinant Human Follicle-Stimulating Hormone (FSH) in Serum-Containing Versus Protein-Free Culture Media. Mol Biotechnol. 2017; 37 (4): 1-9. DOI: 10.1007/s12033-017-0037-4.

11. N akamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 2000; 28 (1): 292.

12. K ovnir S.V., Orlova N.A., Khodak C. et al. Approaches to Controlled Co-Amplification of Genes for Production of Biopharmaceuticals: Study of the Insertion and Amplification Dynamics of Genetic Cassettes in the Genome of Chinese Hamster Ovary Cells during Co-Expression of Compatible Pair of Plasmids. Bull Exp Biol Med. 2017; 163 (2): 245-9.

13. Ковнир С.В., Орлова Н.А., Воробьев И.И. и др. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека, клетка СНО – продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека и способ получения указанного фактора. Патент РФ № 2585532. 2015; Бюл. № 15. URL: https://edrid.ru/rid/216.015.4457.html [Дата доступа: 20.05.2017].

14. Ur laub G., Kas E., Carothers A.M., Chasin L.A. Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from culturedmammalian cells. Cell. 1983; 33 (2): 405-12.