Взаимосвязь полиморфизма rs1799983 гена NOS3 с риском развития преэклампсии и восприимчивостью к SARS-CoV-2 во время беременности

Введение / Introduction

Преэклампсия (ПЭ) – жизнеугрожающее осложнение беременности, родов и послеродового периода, в основе развития которого лежит системная эндотелиальная дисфункция. Эндотелий представляет из себя монослой из (1–6)×10¹³ клеток, выстилающих кровеносные сосуды и образующий поверхность, оцениваемую в 3000–6000 м². Исходно считалось, что он выполняет исключительно барьерную функцию. Согласно современным представлениям, эндотелий – это эндокринный орган, продуцирующий вазоактивные медиаторы, цитокины и активные формы кислорода [1]. Доказано, что эндотелий участвует в регуляции многих биологических процессов, включая сосудистый гомеостаз, коагуляцию, фибринолиз, миграцию клеток и воспалительные реакции [2]. Дисфункция эндотелия – это стойкое изменение его активности, т. е. неспособность выполнять заложенные функции [1]. Характерными клиническими проявлениями эндотелиальной дисфункции во время беременности являются, в том числе, артериальная гипертензия (АГ), протеинурия и отеки [3]. У женщин с ранней манифестацией ПЭ (до 34 недель гестации) эндотелиопатия носит приобретенный характер. К ее развитию в период гестации приводит цепочка событий, следующая за неполной инвазией трофобласта и нарушением процесса ремоделирования сосудов. Системное повреждение эндотелия в данном случае обусловлено воздействием на него антиангиогенных факторов и провоспалительных цитокинов, вырабатываемых поврежденной вследствие мальперфузии плацентой [4]. Поздняя ПЭ, дебютирующая не ранее 34 недель гестации, на сегодня рассматривается как проявление существовавшей ранее эндотелиопатии. Системная сосудистая дисфункция у этой группы пациенток, возможно, имеет врожденный, генетически обусловленный характер. Развивающаяся в ходе гестации ПЭ может стать первой ее клинической манифестацией в жизни женщины, но, как правило, не последней [5]. Известно, что пациентки, перенесшие ПЭ, в отдаленном будущем подвержены риску развития соматической патологии, ассоциированной с системной эндотелиопатией: гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, инсульта, сахарного диабета, когнитивных расстройств, венозных тромбоэмболий [6][7]. И если в случае ранней ПЭ их развитие можно рассматривать как ее отдаленные последствия, то у женщин с поздней ПЭ в анамнезе это закономерные проявления имевшейся ранее сосудистой дисфункции.

Эндотелиальная дисфункция, клинически проявляющаяся сочетанием АГ и протеинурии, не является специфичной для беременности; она может возникать у небеременных женщин после вирусной инфекции, такой как SARS-CoV-2 [5]. С самого начала пандемии было признано, что COVID-19 является заболеванием эндотелия. SARS-CoV-2 обладает сродством к рецептору ангиотензинпревращающего фермента 2 (англ. angiotensin-converting enzyme 2, ACE2). Поскольку ACE2 экспрессируется в эндотелиальных клетках, последние становятся мишенями для SARS-CoV-2, что приводит к иммуноопосредованному повреждению эндотелия и последующей активации системы комплемента. Таким образом, COVID-19 и ПЭ имеют схожие сценарии патогенеза, в основе которых лежит системное повреждение эндотелия [8].

Артериальная гипертензия – ключевое проявление сосудистой дисфункции, возникающее вследствие системной вазоконстрикции. Регуляция артериального давления (АД) осуществляется в том числе гуморальными факторами. Один из важнейших из них – оксид азота (NO) – бесцветный газ с коротким периодом полураспада. Синтез NO осуществляется из L-аргинина путем присоединения молекулярного кислорода [9]. В норме эндотелий осуществляет непрерывное его высвобождение, что обеспечивает контроль тонуса сосудов за счет вазодилатирующего действия NO. Кроме того, он препятствует адгезии клеток крови к эндотелию и обладает антипролиферативным эффектом. NO во многом определяет гомеостаз клетки, регулируя многие физиологические процессы, включая компенсаторно-адаптивную реакцию на негативные воздействия и апоптоз. При беременности известна роль NO в обеспечении нормальной плацентации, оптимальной дифференцировки и инвазии клеток трофобласта. Дисфункция эндотелия при ПЭ, с одной стороны, приводит к снижению биодоступности NO, что, наряду с активацией ренин-ангиотензин-альдостероновой системы ведет к повышению резистентности периферических сосудов. Кроме того, под воздействием оксидативного стресса нарушается непосредственно продукция NO вследствие угнетения фермента NO-синтазы (англ. nitric oxide synthase, NOS) [10]. На фоне ПЭ происходит как снижение продукции NO, так и его биодоступности, что ведет к увеличению резистентности сосудов и, как следствие, АГ [11].

На сегодня доказано наличие взаимосвязи rs1799983 гена NOS3 с развитием сердечно-сосудистых заболеваний (гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда), а также ишемического инсульта, болезни Альцгеймера и злокачественных новообразований [12–15]. Интерес представляет изучение генетической предрасположенности к дисфункции эндотелия у беременных с ПЭ и у беременных с коронавирусной инфекцией.

Цель: исследование ассоциации однонуклеотидного полиморфизма rs1799983 гена NOS3 с риском развития ПЭ и восприимчивостью к SARS-CoV-2 во время беременности у женщин, проживающих на территории Республики Татарстан.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

На базе ГАУЗ ГКБ № 7 им. М.Н. Садыкова г. Казани проведено наблюдательное ретроспективное исследование «случай-контроль». Обследовано 416 беременных, проживающих на территории Республики Татарстан.

Первую группу исследования составили 119 беременных с подтвержденным диагнозом ПЭ, не имевших признаков вирусной инфекции. Вторая группа включала 98 беременных со среднетяжелым течением SARS-CoV-2 без АГ. В контрольную группу вошли 199 женщин без признаков вирусной инфекции, не имевших гипертензивных расстройств ни в ходе беременности, ни в анамнезе.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в первую группу: возраст до 40 лет включительно; одноплодная беременность; проживание на территории Республики Татарстан; принадлежность к европеоидной или монголоидной расе; подписанное добровольное информированное согласие на участие.

Критерии исключения из первой группы: перенесенная во время текущей беременности инфекция SARS-CoV-2; отказ от участия в исследовании.

Критерии включения во вторую группу: положительный ПЦР-тест на SARS-CoV-2; возраст до 40 лет включительно; одноплодная беременность; проживание на территории Республики Татарстан; принадлежность к европеоидной или монголоидной расе; подписанное добровольное информированное согласие на участие.

Критерии исключения из второй группы: наличие артериальной гипертензии; положительный ПЦР-тест на грипп (микст-инфекция); отказ от участия в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: возраст до 40 лет включительно; одноплодная беременность; доношенный срок беременности; проживание на территории Республики Татарстан; принадлежность к европеоидной или монголоидной расе; подписанное письменное информированное согласие.

Критерии исключения из контрольной группы: перенесенная во время текущей беременности инфекция SARS-CoV-2; наличие задержки роста плода; преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты; антенатальная гибель плода; преждевременный разрыв плодных оболочек; привычное невынашивание беременности в анамнезе; отказ от участия в исследовании.

Методы исследования / Study methods

Молекулярно-генетический анализ был выполнен в Центральной Научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России. Выделение ДНК проводилось из цельной венозной крови, набранной в пробирки с антикоагулянтом – хелатирующим агентом этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Экстракцию ДНК осуществляли с применением наборов «ДНК-сорб-В» (Амплисенс, Россия), после чего методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени производилось генотипирование полиморфизма rs1799983 гена NOS3. На этом этапе нами были использованы реактивы отечественной компании «Синтол» (Россия).

Наличие взаимосвязи между носительством указанного полиморфизма с развитием ПЭ, а также с восприимчивостью к SARS-CoV-2 оценивали с применением различных моделей наследования: доминантной, рецессивной, мультипликативной, аддитивной и общей. Перед проведением сравнительного анализа выборка оценивалась на соответствие равновесию Харди–Вайнберга.

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистический анализ полученных результатов выполнялся с применением программных продуктов Statistica (StatSoft Inc., США). Статическая значимость различий распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 1799983 гена NOS3 между группами устанавливалась с применением критерия χ². Значимыми считали различия при p < 0,05. Влияние выявленных изменений на вероятность возникновения ПЭ определялась с помощью отношения шансов (ОШ).

Результаты / Results

Группы исследования оказались сопоставимы по возрасту и паритету участниц. Так, средний возраст пациенток с ПЭ составил 29,0 ± 5,3 лет, беременных с SARS-CoV-2 – 28,78 ± 5,58 лет, в контрольной группе – 30,0 ± 5,2 лет (р > 0,05). Доля первородящих среди участниц с ПЭ составила 43,7 %, среди пораженных SARS-CoV-2 – 42,9 %, в группе контроля – 35,2 % (р > 0,05), доля повторнородящих – 56,3, 57,1 и 64,8 % соответственно (р > 0,05). Структура экстрагенитальной патологии среди обследованных женщин приведена в таблице 1.

Сравнение частоты экстрагенитальной патологии и осложнений беременности производилось между группами сравнения и контролем. Исходя из представленных данных, пациентки с ПЭ чаще страдали ожирением, гестационным сахарным диабетом и анемией, чем участницы из контрольной группы (р < 0,05); частота встречаемости угрожающего выкидыша, рвоты беременных была также выше (p < 0,05). У пациенток с коронавирусной инфекцией чаще, чем в контрольной группе, выявляли инфекции мочевыводящих путей при беременности (р < 0,05).

Результаты проверки распределения аллелей и генотипов полиморфизма rs1799983 гена NOS3 не выявили отклонений от равновесия по Харди–Вайнбергу. Число пациенток, гомозиготных по аллелю G (G/G), гетерозиготных (G/T) и гомозиготных по аллелю T (TT) генотипов rs1799983 в группе беременных с ПЭ составило 71,4, 25,2 и 3,4 %, в группе с коронавирусом – 64,3, 35,7 и 0,0 %, в контрольной группе – 59,3, 36,2 и 4,5 % соответственно (табл. 2). Для сравнения: в мировой популяции распространенность генотипа G/G достигает 69,4 %, G/T – 26,0 %,T/T – 4,6 % [19], что сопоставимо с полученными нами результатами.

Носительство мутантного аллеля G у женщин значимо повышало риск развития ПЭ (ОШ = 1,01–2,34; χ² = 4,09; р = 0,04), в то время как носительство аллеля Т снижало. Гомозиготный генотип GG был ассоциирован с повышением риска ПЭ (ОШ = 1,05–2,80; χ² = 4,08; р = 0,04) (табл. 3).

Таким образом, исследование полиморфизма rs1799983 гена NOS3 продемонстрировало статистическую значимость между группами обследованных для рецессивной, аддитивной и мультипликативной моделей наследования (р < 0,05). Согласно полученным результатам, носительство аллеля G и генотипа G/G полиморфизма rs1799983 гена NOS3 ассоциировано с риском развития ПЭ.

Анализ аллелей и генотипов беременных с коронавирусной инфекцией, напротив, не выявил значимых различий с контрольной группой ни для одной модели наследования (р > 0,05), что свидетельствует об отсутствии влияния изучаемого полиморфизма на восприимчивость к SARS-CoV-2 во время беременности (табл. 4). Носительство аллеля G и генотипа G/G полиморфизма rs1799983 гена NOS3 не повышает риска коронавирусной инфекции, во всяком случае среднетяжелого течения.

Таким образом, выявлено наличие взаимосвязи носительства полиморфизма rs1799983 гена NOS3 с риском развития ПЭ, но не с восприимчивостью к SARS-CoV-2 в период гестации.

Обсуждение / Discussion

Преэклампсия – осложнение беременности, связанное с высоким риском неблагоприятных исходов для матери и плода. Сосудистая дисфункция, лежащая в основе ее патогенеза, приводит к развитию материнского синдрома – клиническим проявлениям ПЭ [16][17]. Сходные повреждения эндотелия наблюдаются и при SARS-CoV-2, что определяет течение COVID-19 и его отдаленные последствия [18]. Важнейшим фактором его функциональной целостности является NO, вырабатываемый в клетках эндотелия ферментом эндотелиальной синтазой оксида азота (eNOS).

Ген NOS3, кодирующий eNOS, представляет собой интересную кандидатуру на роль фактора, влияющего на развитие ПЭ. Он расположен на длинном плече 7-й хромосомы в позиции 7q36.1, включает в себя 26 экзонов и обладает высокой полиморфностью. Известно, что полиморфизмы rs1799983, rs2070744, rs3918226, а также полиморфизм в интроне 4 VNTR (англ. variable number tandem repeat; полиморфизм переменного числа тандемных повторов) оказывают влияние на экспрессию и активность фермента eNOS. Однонуклеотидный полиморфизм rs1799983 (G894T, Glu298Asp) характеризуется заменой гуанина на тиамин в положении 894 гена NOS3. Как следствие, происходит преобразование структурных и функциональных свойств белка в результате замещения глутамина на аспартат в позиции 298. Среди возможных генотипов: G/G, G/Т, Т/Т. В экспериментах in vitro было обнаружено снижение активности фермента eNOS и продукции NO в клетках, несущих данный полиморфизм [19]. По результатам нашего исследования, носительство полиморфизма rs1799983 NOS3 ассоциировано с риском ПЭ во время беременности, что не противоречит данным литературных источников. В 2020 г. были опубликованы результаты метаанализа 35 исследований «случай–контроль» (n = 10055), которые также продемонстрировали взаимосвязь полиморфизма rs1799983 гена NOS3 с возникновением ПЭ. При стратификации риска по этническому признаку более высокая предрасположенность к данному осложнению гестации была обнаружена у представительниц европеоидной расы в сравнении с женщинами негроидной и монголоидной рас [20]. Метаанализ Е. Tesfa с соавт., датированный 2023 г., включивший 47 исследований (n = 13795), также подтвердил, что наличие полиморфизма rs1799983 у женщин увеличивает риск развития ПЭ при беременности [21].

Генотипирование rs1799983 и других полиморфных вариантов NOS3 у 457 представительниц российской популяции проводилось Е.А. Рокотянской с соавт. (2020 г.). Оно показало, что совокупность аллелей изучаемого полиморфизма и NOS3 Т(-786)С чаще встречается у беременных с ПЭ (в том числе на фоне хронической АГ) в сравнении с пациентками с нормотензией (р < 0,05) [22]. Наличие взаимосвязи rs1799983 гена NOS3 с развитием ПЭ также выявили исследования, проведенные в Иране (n = 300; p < 0,05) и Пакистане (n = 600; p < 0,05). Напротив, в популяции беременных Тайваня связи между носительством данного полиморфизма и ПЭ найдено не было (n = 259; p > 0,05) [23–25].

Схожесть изменений в сосудистой стенке при ПЭ и COVID-19 подтолкнули к гипотезе о возможном влиянии полиморфизма rs1799983 гена NOS3 на восприимчивость к SARS-CoV-2. Она была выявлена в исследовании N. Şenkal c соавт., проведенном на небеременных пациентах в Турции (n = 384). Согласно его результатам, при наличии данного полиморфизма имелся повышенный риск развития COVID-19 [26]. Однако, по полученным нами данным, взаимосвязь исследуемого полиморфизма с восприимчивостью к SARS-CoV-2 во время беременности не была подтверждена. Возможно, это связано с гендерными различиями между участниками приведенных исследований. Известно, что предрасположенность к SARS-CoV-2 у мужчин выше, чем у женщин, и если N. Şenkal c соавт. обследовали пациентов обоих полов, то наша выборка была представлена лишь женщинами. Кроме того, расовый состав Турции отличается от такового в Республике Татарстан, что подразумевает генетические вариации между населением. Так или иначе, влияние генетического фактора на восприимчивость к SARS-CoV-2 неоспоримо. Генотипирование 33923 пациентов с COVID-19 позволило идентифицировать 10 полиморфизмов и 21 мутацию в гене ангиотензинпревращающего фермента 2 (англ. angiotensin-converting enzyme 2, ACE2), а также 13 полиморфизмов и 12 мутаций в гене трансмембранной сериновой протеазы 2-го типа (англ. transmembrane serine protease type 2, TMPRSS2), предрасполагающей к COVID-19, а также влияющей на остроту проявлений заболевания и его исходы [27]. Кроме того, на восприимчивость к SARS-CoV-2, безусловно, влияют и негенетические факторы, как, например, возраст, полиморбидность, социальная принадлежность и пр.

Роль генетического фактора в развитии ПЭ также не вызывает сомнений. Эпидемиологически доказано, что отягощенный семейный анамнез по данной патологии повышает риск ее возникновения у родственников первой линии родства в 5 раз, у родственника второй линии родства – в 2 раза. Проведение полногеномных ассоциативных исследований пока не позволило обнаружить ген, ответственный за развитие ПЭ. Однако известно более 100 полиморфных вариантов генов, носительство которых предрасполагает к гипертензивным расстройствам при беременности [8]. Сами по себе они не являются прямым и неизбежным фактором возникновения патологии, однако они могут модулировать риск ее развития в зависимости от действия экзогенных факторов. Тем не менее молекулярно-генетические исследования открывают новые возможности для раннего прогнозирования ПЭ, в том числе на этапе планирования беременности. Необходимы дальнейшие изыскания, направленные на поиск генов-кандидатов, связанных с развитием ПЭ, для включения их в алгоритмы ее персонифицированной предикции и ранней диагностики.

Ограничения исследования / Study limitations

К ограничениям проведенного нами исследования следует отнести объем выборки, возможные неточности анамнестических данных, представленных пациентами, а также высокую этническую разнородность населения, проживающего на территории Республики Татарстан, что могло отразиться при обобщении результатов генотипирования.

Заключение / Conclusion

Проведенное исследование выявило ассоциацию носительства полиморфизма rs1799983 гена eNOS с риском развития ПЭ у женщин, проживающих на территории Республики Татарстан, однако не было найдено его взаимосвязи с восприимчивостью к SARS-CoV-2 во время беременности.