Сравнительная оценка изменений в системе ADAMTS-13/фактор фон Виллебранда при одноплодной и бихориальной биамниотической беременности

Введение / Introduction

Широкое внедрение лечения бесплодия с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) со стимуляцией овуляции, включая программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), значительно увеличило количество дизиготных двоен. В 2020 г. в России 17,5 % многоплодных родов произошли благодаря ВРТ. Многоплодная беременность существенно влияет на характер течения гестационной адаптации, в том числе системы гемостаза, уже начиная с I триместра [1–3], что создает базис для формирования осложненного течения и неблагоприятного исхода гестации. Особая ситуация возникает при многоплодной беременности после ЭКО, когда помимо эффекта гормонов, а в ряде случаев и синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), имеет место так называемый гиперплацентоз и дополнительная активация гемостаза. Технология ВРТ с гормональной стимуляцией овуляции сама по себе сопряжена со значительными изменениями гемостаза, что повышает риск тромбообразования даже при одноплодной беременности [4] и плацента-ассоциированных гестационных осложнений, преждевременных родов и послеродовых кровотечений [5–7]. Гестационная адаптация при многоплодной индуцированной беременности имеет высокий риск срыва компенсаторных механизмов [3], что, как правило, ведет к тяжелым формам преэклампсии (ПЭ) и нарушению в системе мать–плацента–плод.

Часто пациентки, планирующие беременность с помощью ВРТ, имеют отягощенный акушерский анамнез, соматическую патологию и клинические эквиваленты состояний, при которых тромбовоспалительные процессы носят хронический рецидивирующий характер [6], т. е. имеются исходные отклонения в системе гемостаза и условия, определяющие измененную активность ее функционирования. Развитие плаценты или плацент, активирующее внутрисосудистое свертывание, усиливает исходные нарушения гестационной адаптации. В связи с этим прогноз течения беременности в этой когорте пациенток зависит от целенаправленной диагностики и этапной оценки риска срыва компенсаторных механизмов, а также их коррекции и эффективности профилактических мероприятий с целью пролонгирования беременности до оптимальных сроков родоразрешения.

Последние десятилетия глубокий научный интерес представляет изучение металлопротеиназы ADAMTS-13 (англ. a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif, member 13), ее биохимии, биологического значения и роли в патогенезе патологических состояний, ассоциированных с нарушением гемостаза. И акушерская практика не стала исключением. В открытом доступе можно найти публикации по изменению уровня ADAMTS-13 в гестационный период [9] и работы по изучению ее влияния на исходы беременности. Высказаны предположения, что оценка этой металлопротеиназы может использоваться в качестве прогностического маркера осложненного течения беременности.

Биологическая роль металлопротеиназы ADAMTS-13 заключается в расщеплении сверхкрупных молекул фактора фон Виллебранда (англ. ultralarge vWF multimers, UL-vWF). Мультимеры vWF обладают высокой тромбогенностью, выступая в роли адгезивного посредника между поврежденным сосудистым эндотелием и кровяными пластинками в процессе гемостаза. Кроме того, vWF является своего рода транспортером плазменного фактора свертывания VIII и защищает его от ранней деградации [8]. ADAMTS-13 способна воздействовать и на трансмембранные фрагменты UL-vWF и на плазменные [9][10], регулируя его активность и клинические эффекты. В условиях дефицита ADAMTS-13 уровень vWF беспрепятственно нарастает, что приводит к тромбированию микрососудов и последующей тромбоцитопении потребления. Дефицит металлопротеиназы ADAMTS-13 может быть приобретенным и генетически обусловленным. Тяжелые формы (обычно при врожденном дефиците) клинически проявляются тромботической тромбоцитопенической пурпурой [11].

Существует мнение, что ADAMTS-13, как и vWF, принимает участие в процессах инвазии трофобласта. Исследования динамики показателя ADAMTS-13/vWF у беременных демонстрируют увеличение vWF со сроком гестации. Различия в содержании антигена фактора фон Виллебранда (vWF:Ag) статистически значимы во II и III триместрах в сравнении с небеременными (p < 0,01) [9]. Неоднозначны данные по ADAMTS-13: от соответствия уровню у небеременных [12] до снижения значений, преимущественно со II триместра [13][14], более выраженного при осложненном течении беременности (развитии ПЭ).

По данным, представленным в работе К.Н. Григорьевой с соавт. (2023), с прогрессированием неосложненной беременности уровень активности ADAMTS-13 снижается, что не является статистически значимым по сравнению с небеременными. Отмечено снижение значений антигена ADAMTS-13 (ADAMTS-13:Ag) с началом II триместра (р < 0,01) с сохранением показателя в пределах референсных значений даже в III триместре гестации [9].

Цель: сравнить изменения в оси металлопротеиназа ADAMTS-13/vWF у беременных с бихориальной биамниотической двойней и одноплодной беременностью, наступившей самопроизвольно и после ЭКО.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

В работе представлены результаты проспективного обсервационного рандомизированного контролируемого исследования. Проанализированы результаты обследования беременных с физиологически протекающей самопроизвольно наступившей одноплодной (группа 1) и многоплодной беременностью двойней (группа 2) и с одноплодной (группа 3) и многоплодной бихориальной биамниотической двойней (группа 4), наступившей после применения ЭКО. В качестве первичных конечных точек оценивали уровни vWF и ADAMTS-13 (антигена и активности). Результаты сравнивали по группам в зависимости от характера наступления (самопроизвольно или с помощью ЭКО) и варианта развития беременности (одноплодной или беременность двойней). Наблюдение продолжали в течение гестационного периода и после родов. Исследование проводили в динамике: всем беременным в I, II и III триместрах и при планировании ЭКО до начала гормональной стимуляции овуляции (в группах 3 и 4). Для проведения обследований были выбраны сроки беременности в каждом из триместров, в которые предполагалась явка беременных на консультативный прием: 6–8 нед, 18–22 нед и 30–34 нед беременности. В исследуемые группы включались женщины, удовлетворяющие критериям включения в исследование.

Критерии включения, невключения и исключения / Inclusion, non-inclusion and exclusion criteria

Критерии включения: спонтанная одноплодная и бихориальная биамниотическая беременность двойней (группы 1 и 2); наступившая с помощью ЭКО одноплодная и многоплодная (бихориальной биамниотической двойней) беременность (группы 3 и 4); неосложненное течение гестационного периода; подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии невключения: беременность с монохориальной двойней и более чем двумя плодами; применение препаратов, оказывающих влияние на параметры гемостаза; наличие у беременных экстрагенитальных заболеваний и острых респираторных вирусных инфекций.

Критерии исключения: самопроизвольное прерывание беременности; развитие гестационных осложнений (СГЯ, ПЭ, антенатальная гибель одного или обоих плодов), которые могли повлиять на параметры гемостаза; выявленная генетическая и приобретенная (циркуляция антифосфолипидных антител) тромбофилия; необходимость применения антикоагулянтных препаратов во время беременности; отказ от участия в исследовании.

Группы обследованных / Study groups

На основании применяемых критериев для анализа были отобраны данные обследования 51 беременной в возрасте от 24 до 39 лет с одноплодной (группа 1, n = 34) и многоплодной бихориальной биамниотической (группа 2, n = 17) самопроизвольно наступившей беременностью и 68 беременных в возрасте от 27 до 42 лет с одноплодной (группа 3, n = 34) и многоплодной бихориальной биамниотической двойней (группа 4, n = 34), наступившей в результате применения ЭКО и переноса эмбриона с использованием собственных яйцеклеток в стимулированном цикле, составивших основные исследуемые группы. Все пациентки наблюдались в Перинатальном центре ГБУЗ ГКБ № 67 им. Л.А. Ворохобова ДЗМ и ООО «Медицинский женский центр» (Москва), период наблюдения составил с 2018 по 2024 гг.

Показанием к ЭКО у пациенток, включенных в исследование, было бесплодие: у 21 (30,9 %) – трубное и трубно-перитонеальное, у 10 (14,7 %) – эндокринное, у 9 (13,2%) – обусловленное эндометриозом при безуспешном лечении его в течение 2 лет, у 11 (16,2 %) – обусловленное мужским фактором, у 13 (19,1 %) – неясного генеза, у 4 (5,9 %) – из-за сочетания мужского бесплодия с трубно-перитонеальным фактором (n = 3) или эндометриозом (n = 2) у женщины.

Включенные в исследование беременные с самопроизвольно наступившей беременностью были сопоставимы с пациентками после ЭКО по возрасту, группе крови, индексу массы тела и гестационному сроку проводимого обследования (p > 0,05). Средний возраст беременных составил 33,8 ± 2,7 лет после ЭКО и 33,7 ± 1,9 лет с самопроизвольно наступившей беременностью (табл. 1).

Методы исследования / Study methods

Количественная оценка уровня антигена ADAMTS-13 (АDAMTS-13:Ag), активности ADAMTS-13 (ADAMTS-13:Aс) и антигена vWF (vWF:Ag) проводилась методом хромогенного иммуноферментного анализа с помощью набора ТECHNOZYM^® (Technoclone, Aвстрия). Для анализа использовалась плазма (с 3,2 % раствором цитрата натрия), бедная тромбоцитами, полученная из венозной крови. Кровь для исследования брали путем венопункции сухой стерильной иглой (в вакуумные пробирки в соотношении кровь:реагент = 9:1). Центрифугирование образца крови проводилось при 3000 g в течение 20 мин при температуре 20–24 °C. Полученный после центрифугирования образец плазмы помещался в чистый сухой эппендорф, хранился при –80 °С.

Референсные значения исследуемых параметров для здоровых людей: ADAMTS-13:Ag – 0,41–1,41 Ед/мл, ADAMTS-13:Aс – 0,4–1,3 Ед/мл, vWF:Ag – 0,5–1,5 Ед/мл (50–150 %).

Методы статистического анализа / Statistical analysis

Для систематизации полученных данных и их статистической обработки был использован пакет электронных таблиц Microsoft Office Excel 2019 (Microsoft, США) и программное обеспечение для статистических расчетов StatTech v. 1.2.0 (ООО «Статтех», Россия, 2020). Показатели, определяемые в рамках поставленных задач, представлены с применением методов описательной статистики: в виде среднего (М ± SD) со стандартным квадратичным отклонением (возраст пациенток, гестационный возраст, параметры гемостаза), долей (в %) от абсолютного числа (для качественных показателей), медианы (Ме) и разброса данных с 95 % доверительным интервалом (ДИ). Для сравнения качественных переменных использовали критерий χ²; статистическая значимость различий расценивалась как значимая при p < 0,05.

Результаты / Results

Результаты оценки изменений оси металлопротеиназа ADAMTS-13/vWF у беременных с одноплодной и многоплодной беременностью, наступившей самопроизвольно и после ЭКО, отражены в таблицах 2 и 3. Данные представлены как сравнение показателей при одноплодной и многоплодной беременности, неиндуцированной беременности и беременности после ЭКО.

При самопроизвольно наступившей беременности (в группах 1 и 2) уровень vWF в I триместре соответствовал референсному диапазону для небеременных и при одноплодной и при многоплодной беременности, медиана составила 0,934 Ед/мл и 1,062 Ед/мл по группам, соответственно (p = 0,00118). С увеличением срока гестации показатель демонстрирован тенденцию к росту с выходом за пределы референсного диапазона значений для небеременных у части беременных, начиная со II триместра, более выраженно при беременности двойней (p < 0,001). Наиболее выраженными изменения оказались в III триместре: 1,869 [ 1,740; 1,916] Ед/мл и 2,169 [ 1,966; 2,261] Ед/мл при одноплодной беременности и беременности двойней (p < 0,001), соответственно (табл. 2).

Полученные значения уровня антигена АDAMTS-13 находились в пределах референсного диапазона в обеих группах, но демонстрировали тенденцию к снижению, более выраженную при многоплодной беременности (p < 0,001). Медиана АDAMTS-13 при одноплодной беременности составила 0,901 [ 0,890; 0,97] Ед/мл в I триместре, 0,855 [ 0,726; 0,92] Ед/мл во II триместре и 0,787 [ 0,720; 0,892] Ед/мл в III триместре (группа 1), при бихориальной биамниотической беременности – 0,756 [ 0,747; 0,814] Ед/мл, 0,726 [ 0,717; 0,782] Ед/мл и 0,66 [ 0,605; 0,747] Ед/мл (группа 2), по триместрам соответственно. Активность АDAMTS-13 с прогрессированием беременности снижалась менее выраженно, в I и II триместре соответствовала норме для небеременных. Активность АDAMTS-13 была ниже при многоплодной беременности, но статистически значимой разницы среди пациенток с одноплодной и многоплодной беременностью выявлено не было.

Тенденция к росту vWF и снижение ADAMTS-13 определило тенденцию к снижению с прогрессированием беременности отношения ADAMTS-13:Ag/vWF:Ag, характеризующего изменения в системе ADAMTS-13/vWF. Изменения отношения ADAMTS-13:Ag/vWF:Ag, наблюдаемое у пациенток по мере развития беременности, отражает прогрессирующую дисфункцию эндотелия, которая, как показало наше исследование, в большей степени выражена при беременности двойней даже при физиологическом ее протекании, что указывает и на более высокий риск осложненного течения многоплодных беременностей.

У всех пациенток с беременностью после ЭКО до начала программы стимуляции овуляции изучаемые показатели были в референсном диапазоне и статистически значимо не различались по группам (с одноплодной и многоплодной беременностью). С наступлением беременности уровень vWF прогрессивно нарастал, начиная с ранних сроков беременности, что, вероятно, было реакцией на гормональную стимуляцию. Медиана в I триместре одноплодной беременности (группа 3) составила 1,271 [ 1,160; 1,376] Ед/мл, что достоверно (p < 0,001) превышало соответствующий показатель при неиндуцированной беременности (группа 1). При беременности двойней (группа 4) уровень vWF в 2 раза превышал референсные значения для небеременных уже в I триместре и был статистически значимо (p < 0,001) выше соответствующих значений у пациенток с одноплодной индуцированой беременностью (группа 3) и многоплодной неиндуцированной беременностью (группа 2). Снижение уровня антигена ADAMTS-13 также наблюдалось с ранних сроков беременности, при бихориальной биамниотической двойне (группа 4) показатель в I триместре был до двух раз ниже соответствующего значения до начала стимуляции овуляции. Активность металлопротеиназы ADAMTS-13 при одноплодной беременности (группа 3) и беременности двойней после ЭКО (группа 4) по триместрам статистически значимых различий не демонстрировала, но была ниже по сравнению с беременностью, наступившей самопроизвольно, без применения ВРТ (группа 1 и 2), соответствующих сроков. Отношение ADAMTS-13:Ag/vWF:Ag было в большей степени снижено при многоплодной беременности после ЭКО (группа 4).

Динамика значений vWF:Ag и ADAMTS-13:Ag при одноплодной беременности и беременности двойней, наступившей спонтанной и с помощью ЭКО, по триместрам представлена на рисунках 1 и 2.

Обсуждение / Discussion

Повышенный уровень vWF является важным фактором риска развития артериальных и венозных тромбозов. Интерес к функционированию системы контроля эффектов vWF–ADAMTS-13 позволил раскрыть молекулярные механизмы взаимодействия АDAMTS-13 и vWF в условиях повреждения микрососудов. Металлопротеиназа ADAMTS-13, расщепляющая vWF, выполняет важную роль регулятора, определяющего гемостатическую активность vWF. Патологические состояния любого генеза, сопровождающиеся повреждением эндотелия, активируют эту систему, поскольку, как реакция на повреждение, из телец Вейбеля–Паладе происходит выброс vWF, что, в свою очередь, требует эффектов АDAMTS-13. В итоге металлопротеиназа расходуется с развитием ее относительной недостаточности. В последние годы изучение роли АDAMTS-13 и нарушений в системе АDAMTS-13/vWF продолжается. Показано, что нарушение регуляции в оси АDAMTS-13/vWF наблюдается при воспалении, которому свойственна эндотелиальная дисфункция, в особенности при гипервоспалении, что было в условиях инфекции COVID-19 и сопровождалось микротромбозами и нарушением микроциркуляции, являющейся патогенетическим механизмом развития полиорганной недостаточности [15]. В акушерской практике эндотелиопатия является важным патогенетическим механизмом развития ПЭ и ассоциированных с ней гестационных осложнений [9]. Тромбозы, тромбоэмболии и ПЭ являются грозными осложнениями, поиск прогностических маркеров которых продолжается. Изменения в системе АDAMTS-13/vWF могут быть рассмотрены в качестве прогностического маркера, отражающего состояние эндотелиальной функции и тромботического риска. Но если в мировой литературе представлены данные о динамике уровней vWF и АDAMTS-13 при одноплодной физиологической и при осложненной преэклампсией беременности, то для случаев гестации двойней, в том числе после ЭКО, данных нет.

Любая беременность характеризуется значительными изменениями в системе гемостаза, определяющими ее гестационную адаптацию. Как было показано нами ранее, гестационная адаптация системы гемостаза при многоплодной беременности претерпевает значительные изменения, что отражает динамика значений фибриногена, активированного частичного тромбопластинового времени, протромбинового и тромбинового времени, естественных антикоагулянтов и агрегационной активности тромбоцитов [3]. Во время ЭКО в крови значительно повышается концентрация эстрадиола, что может напрямую влиять на систему гемостаза. Е. Westerlund с соавт. представили данные по увеличению антигена и активности vWF и снижению циркулирующего антигена и активности ADAMTS-13 при увеличении уровня эстрадиола в программе стимуляции овуляции с помощью фолликулостимулирующего гормона на первом этапе ЭКО [16]. При увеличении уровня эстрадиола в среднем со 154 пг/мл при пониженной регуляции до 5889 пг/мл при высокой стимуляции (диапазон 1620–19500 пг/мл) антиген и активность vWF увеличивались с 0,75 ± 0,22 кМЕ/л до 1,06 ± 0,40 кМЕ/л (p < 0,001) и с 0,83 ± 0,26 кМЕ/л до 1,24 ± 0,48 кМЕ/л (p < 0,001) соответственно; антиген ADAMTS-13 снижался с 72,2 ± 13,5 % до 67,9 ± 9,9 % (p < 0,05, p = 0,01), а активность ADAMTS-13 – с 88,6 ± 18,3 % до 80,8 ± 15,7 % (p < 0,01). Это может частично объяснить, почему у пациентов в программах ЭКО повышен риск развития тромботических осложнений.

Проведенный анализ представленных в работе данных позволил выявить важные закономерности функционирования системы АDAMTS-13/vWF при неосложненном течении многоплодной беременности, в том числе наступившей с помощью ВРТ. При применении гормональной стимуляции овуляции в программах ЭКО нарушается хронологическая последовательность гестационной адаптации системы гемостаза. Хорошо известно о влиянии на эндотелий сосудов половых гормонов, что объясняет повышение коагуляционного потенциала в период гестации и может быть причиной значительного его возрастания в условиях ЭКО уже на этапе стимуляции суперовуляции под влиянием биологически активных веществ, высвобождаемых эндотелиоцитами, включая vWF.

Результаты нашего исследования демонстрируют рост уровня антигена vWF пропорционально увеличению срока гестации и снижение уровня ADAMTS-13. Повышение vWF с прогрессированием беременности и снижение АDAMTS-13, вероятно, как результат расходования при относительно сохранной ее активности, отражает повышенный риск тромботических осложнений, ассоциированный с гестационным периодом. Этот риск более высок при многоплодной беременности как результат гиперплацентоза и большей стимуляции высвобождения vWF, на нейтрализацию которого требуется дополнительное количество АDAMTS-13, что отражает динамику его снижения у пациенток с бихориальной биамниотической двойней.

Особенностью индуцированной беременности является высокий коагуляционный потенциал с ранних сроков гестации, поддерживаемый гормонально. Мы наблюдали статистически значимо высокие уровни vWF и низкие уровни АDAMTS-13 при одноплодной индуцированной беременности, начиная с 6–7-й недели гестации, что соответствовало представленным в работе E. Westerlund с соавт. данным [16], и статистически значимо более выраженные изменения исследуемых показателей при индуцированной беременности двойней. Наблюдаемая тенденция отражает крайне высокий риск срыва механизмов гестационной адаптации при многоплодной беременности, наступившей благодаря применению ВРТ, что повышает риск тромбоза или осложнений, ассоциированных с сосудистой патологией – венозной тромбоэмболии и ПЭ, и поднимает вопрос о целесообразности проведения профилактических мероприятий.

Критериями исключения из представленного исследования были развитие гестационных осложнений (включая ПЭ и гибель одного или обоих плодов антенатально) и СГЯ. Указанные осложнения сопровождаются эндотелиопатией и дополнительной стимуляцией активации факторов системы гемостаза, включая vWF. Исключались также пациентки с выявленной генетической и приобретенной тромбофилией ввиду необходимости применения антикоагулянтных препаратов во время беременности. Это повлияло на количество пациенток в выборке. Таким образом, в работе представлены данные по динамике vWF и АDAMTS-13 только в случаях неосложненного гестационного процесса. Интересным, однако, представляется оценить уровни изучаемых показателей и их динамику и при осложненной беременности и возможности использования их в качестве прогностических маркеров риска осложненного течения многоплодной беременности, включая беременность после ЭКО, что предполагает продолжение исследования в этом направлении.

Заключение / Conclusion

Программы ВРТ с применением стимуляции суперовуляции с последующим переносом эмбриона в полость матки и гормональной поддержкой наступившей беременности сопровождаются усилением прокоагулянтных свойств сосудистого эндотелия, высвобождением vWF, активирующего тромбоциты и коагуляционный каскад с ранних сроков индуцированной беременности даже в отсутствие СГЯ. В большей степени эти изменения выражены при беременности двойней. Гиперреактивность vWF компенсируется расходованием АDAMTS-13, уровень которой снижается критично, что создает условия для срыва гестационной адаптации системы гемостаза и повышает риск тромботических осложнений, акушерской патологии и потери беременности.

Сравнительная оценка изменений в системе ADAMTS-13/фактор фон Виллебранда при одноплодной и бихориальной биамниотической беременности