Изучение особенностей таксономического состава микробиоты кишечника и их связи с гормональным и иммунным статусом у женщин с наружным генитальным эндометриозом

Введение / Introduction

Согласно современным представлениям, эндометриоз рассматривается как иммунновоспалительный эстрогензависимый патологический процесс, связанный с распространением вне слизистой оболочки тела матки ткани, морфофункционально сходной с эндометрием [1]. Медико-социальная значимость проблемы обусловлена широким распространением патологии, ее существенным негативным влиянием на женское репродуктивное здоровье, психологическое состояние и качество жизни. Распространённость наружного генитального эндометриоза (НГЭ) в общей популяции женщин репродуктивного возраста достигает 6–10 %, при этом указанные данные носят аппроксимативный характер, что обусловлено полиморфностью клинической картины и отсутствием высокоинформативных неинвазивных методов диагностики заболевания [2]. Возникающие трудности на диагностическом этапе часто приводят к установке ошибочного диагноза и/или задержке его постановки [3][4], что в последующем ведет к прогрессированию патологии и развитию тяжелых неблагоприятных последствий [5]. Помимо этого, существующие на сегодня стратегии лечения эндометриоза также все еще остаются недостаточно эффективными и сопряжены с высоким процентом развития рецидивов [3].

При этом ключевым аспектом, обуславливающим неполную результативность диагностических и лечебных мероприятий, является недостаток знаний в вопросах этиопатогенеза НГЭ.

Очевидная мультифакториальность патологии определяет наличие различных теорий возникновения заболевания. Отмеченное значимое увеличение концентрации эстрогенов в менструальной крови и в перинеальной жидкости у пациенток с эндометриозом позволяет отнести рассматриваемую патологию к гормонозависимым заболеваниям [6]. Показано, что эстрогены играют ключевое значение в поддержании воспаления и боли, связанной с НГЭ [7].

В дополнение к дисбалансу нейрогуморальной регуляции при эндометриозе имеет место также девиация иммунного ответа. Исследования иммунных аспектов НГЭ указывают на активацию врожденного компонента иммунитета, а также гиперфункцию В-лимфоцитарного звена на фоне развития Т-клеточного дефицита [8][9]. В этом аспекте особо стоит подчеркнуть роль цитокинов, выполняющих функцию медиаторов межклеточных сигналов и являющихся основными регуляторами активности иммунных клеток.

Сегодня одной из наиболее широко принятых теорий развития эктопических тканей эндометрия становится гипотеза ретроградной менструации, на основании которой в 2008 г. впервые было выдвинута концепция о вкладе бактериальной контаминации в патогенез НГЭ [10]. В литературе наблюдается экспоненциальный рост исследований, связанных с изучением влияния кишечной микробиоты на развитие эндометриоза. Известно, что микрофлора кишечника играет не только важную роль в системных метаболических процессах, но и является ключевым регулятором нейрогуморальных осей и иммунных реакций. Многочисленные исследования демонстрируют связь дисбиоза кишечника с нарушением метаболизма эстрогенов, дисбалансом систем врожденного и адаптивного иммунитета и формированием хронического воспаления при ряде патологий [10][11].

Наконец, имеются фундаментальные и клинические исследования, предоставляющие убедительные доказательства изменений кишечного биоценоза при развитии НГЭ [10][12]. В то же время научные сведенья о таксономическом составе микробиоты кишечника у пациенток с эндометриозом характеризуются фрагментарностью и противоречивостью. В доступной литературе имеются лишь единичные публикации, рассматривающие вероятные патогенетические механизмы взаимосвязи нарушений кишечного биоценоза с эндометриозом.

Между тем углубленное изучение профиля микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ потенциально может открывать новые горизонты в отношении разработки инновационных диагностических и терапевтических стратегий данной патологии.

Цель: системная оценка особенностей таксономического состава микробиоты кишечника во взаимосвязи с показателями гормонального и иммунного статуса у пациенток с НГЭ.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

В период 2023–2024 гг. проведено одномоментное контролируемое исследование с участием 63 женщин, наблюдавшихся в Клиническом медицинском многопрофильном центре Святителя Луки ФГАОУ ВО КФУ им. В.И. Вернадского (Симферополь). Согласно дизайну исследования, все участницы исследования были рандомизированы в 2 группы. Основную группу (ОГ) составили 33 пациентки с установленным диагнозом НГЭ, в контрольную группу вошли 30 здоровых женщин, проходивших диспансеризацию на базе медицинского центра.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в основную группу: женщины репродуктивного возраста (18–45 лет); лапароскопически и гистологически верифицированный диагноз НГЭ [1]; подписанное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: женщины репродуктивного возраста (18–45 лет); отсутствие акушерско-гинекологической патологии в анамнезе; подписанное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: женщины в возрасте менее 18 и старше 45 лет; беременность или период лактации; общесоматические заболевания в стадии декомпенсации; злокачественные новообразования любой локализации; органические и функциональные заболевания органов желудочно-кишечного тракта в анамнезе; прием за 1 месяц до включения в исследование препаратов из следующих фармакологических групп – гормональные, иммуномодулирующие, антибактериальные, противовирусные, противогрибковые средства, средства, являющиеся источниками пробиотических бактерий и молочнокислых микроорганизмов; отказ от участия в научном исследовании.

Методы исследования / Study methods

Оценка гормонального статуса / Assessment of hormonal status

Определение содержания гормонов – эстрадиола (Е2), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), пролактина (ПРЛ) в периферической крови обследуемых осуществляли с помощью иммуноферментного и хемилюминесцентного анализа. Отбор проб крови из локтевой вены осуществляли в утренние часы, натощак, на 2–3-й день менструального цикла. Иммуноферментный анализ проводили с помощью коммерческих наборов компании «Алкор Био» (Россия) на анализаторе Labsystems Multiskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия). Хемилюминесцентный анализ осуществляли с использованием автоматизированной аналитической системы Immulite 2000 XPi (Siemens Healthcare Diagnostics, США).

Оценка иммунного статуса / Assessment of immune status

Определение уровня экспрессии цитокинов – интерлейкинов (англ. interleukin, IL) IL-6, IL-8, фактора некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor alpha, TNF-α) производили с использованием иммуноферментного анализа. Отбор проб из локтевой вены осуществляли в утренние часы, натощак, вне зависимости от дня менструального цикла. Исследования проводили с использованием коммерческих наборов компании ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) на анализаторе Labsystems Multiskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия).

Оценка таксономического состава микробиоты кишечника / Assessment of taxonomic intestinal microbiota composition

Для изучения таксономического состава микробиоты кишечника у всех пациенток однократно проводили забор кала. В день забора образцы замораживали и хранили при температурном режиме –20 °C до постановки реакций. Выделение ДНК из полученных образцов проводили согласно инструкции фирмы-производителя с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб-B» (Россия). Концентрацию экстрагированной ДНК измеряли с использованием набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США) на специализированном флуориметре Qubit Fluorimeter (Invitrogen, США).

Оценку таксономического состава проводили методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК (рРНК).

Амплификация гипервариабельных областей V3–V4 гена 16S рРНК проведена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подготовку библиотек осуществляли с использованием наборов NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (New England Biolabs, Германия). Библиотеки секвенировали на платформе Illumina HiSeq 3000 (Illumina, США) парно-концевым методом.

Обработку полученных данных осуществляли при использовании пакетов ПО Trimmomatic [13] и QIIME [14]. Таксономическая принадлежность прочтений осуществлялась с помощью баз данных CosmosID Metagenomics (www.cosmosid.com) и KEGG Pathogen, MicrobeNet (A CDC Virtual Reference Laboratory, https://microbenet.cdc.gov). Анализ α-разнообразия микробного сообщества проводили посредством расчета индекса Chao1, числа обнаруженных таксонов (± SD; Sobs ) и показателя, демонстрирующего реальное количество таксонов (англ. Abundance Coverage Estimator, ACE).

Методы статистического анализа / Statistic alanalysis

Обработка полученных данных проводилась в программе Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Различия рассчитывали при помощи критерия Манна–Уитни. Параметры нормального распределения представляли в формате среднее ± статистическая ошибка среднего (M ± m). Данные с ассиметричным распределением описывали в виде медианы и верхнего и нижнего квартилей (Me [Q₁; Q₃]). Расчет коэффициентов корреляции проводили, используя непараметрический коэффициент Спирмена. Значимость различий устанавливалась при p ≤ 0,05.

Результаты / Results

Клиническая характеристика обследованных женщин / Clinical characteristics of the women examined

Клиническая характеристика пациенток с НГЭ и здоровых женщин представлена в таблице 1. Женщины основной группы и группы контроля были сопоставимы по возрасту (37,0 ± 1,6 лет против 37,7 ± 2,1 лет; р = 0,89) и индексу массы тела (23,0 ± 3,3 кг/м² против 22,06 ± 2,9 кг/м²; р = 0,062). Среди пациенток основной группы у 11 из 35 (31,4 %) установлен НГЭ I–II степени распространенности, у остальных 24 (68,6 %) – НГЭ III–IV степени.

Особенности гормонального статуса обследованных женщин / Features of hormonal status in the women examined

Проведенный анализ содержания гормонов в плазме крови обследованных женщин позволил выделить ряд отличий (табл. 2).

Так, концентрация Е2 у пациенток основной группы с НГЭ была достоверно выше по сравнению с лицами контрольной группы – 75,6 ± 17,2 пг/л против 49,8 ± 15,26 пг/л (р < 0,001). По содержанию ФСГ, ЛГ и ПРЛ значимых различий между группами получено не было (р > 0,05).

Особенности иммунного статуса обследованных женщин / Features of immune status in the women examined

Концентрации IL-6, IL-8, IL-17 и TNF-α в плазме крови пациенток основной группы статистически значимо превышали аналогичные показатели у здоровых женщин из группы контроля (р < 0,001).

При анализе кишечного микробиома методом 16S рРНК секвенирования было идентифицировано 1 463 557 последовательностей с общим числом оснований 633 820 566 и средней длиной 433,1, причем длина в основном распределялась между 421 и 460. При анализе α-разнообразия бактериального сообщества в основной группе было установлено достоверное снижение индекса Chao1 (p = 0,020). Кроме того, у пациенток с НГЭ обращает на себя внимание тенденция к снижению индексов ACE и Sobs (рис. 1), однако не достигающая статистической значимости (р = 0,060; р = 0,064 соответственно).

На уровне филумов соотношение Firmicutes/Bacteroidetes у пациенток с НГЭ было увеличено по сравнению с таковым в группе контроля (p < 0,001). В ходе сравнительного анализа таксономического состава микробиоты среди 20 крупнейших родов в основной группе было зафиксировано достоверное повышение численности Lachnospira (р = 0,001), Blautia (р = 0,008), Dorea (р = 0,041), Streptococcus (p < 0,001), Eubacterium hallii_group (р = 0,009) и достоверное снижение Bifidobacterium (p = 0,001) и Eubacterium eligens_group (р = 0,008) (рис. 2).

Ассоциации таксономического состава кишечной микробиоты с показателями гормонального и иммунного статуса пациенток с наружным генитальным эндометриозом / Associations between taxonomic intestinal microbiota composition and parameters of hormonal and immune status in patients with external genital endometriosis

При изучении взаимосвязи таксономических особенностей кишечного биоценоза с биохимическими показателями пациенток с НГЭ была получена положительная корреляция уровня эстрогена с численностью представителей родов Eubacterium hallii_group (r = 0,69; р = 0,001) и Streptococcus(r = 0,61; p < 0,001). Уровень плазменного TNF-α имел положительную связь с численностью рода Streptococcus (r = 0,89; p < 0,05) и Lachnospira (r = 0,76; p < 0,05), а также отрицательную с Bifidobacterium (r = –0,89; p = 0,020). Также продемонстрирована достоверная отрицательная корреляция между концентрацией IL-8 в плазме крови и представленностью рода Streptococcus (r = –0,95; p < 0,001).

Обсуждение / Discussion

Этиопатогенез эндометриоза имеет мультифакториальный характер. При этом на сегодняшний день не вызывает сомнений сопряженность данного патологического процесса с нарушениями микрофлоры кишечника, что также подтверждается результатами настоящего исследования.

Установлено, что для женщин с НГЭ характерно снижение α-разнообразия микробного сообщества, что присуще широкому спектру патологий, сопровождающихся хронической воспалительной реакцией [15]. Указанные результаты полностью соотносятся с более ранними публикациями зарубежных коллег, где отмечено выраженное снижение как α-, так и β-разнообразия кишечной микробиоты у женщин с эндометриоидными очагами [16].

В рамках текущей работы были также уточнены представления о таксономических и функциональных особенностях состава микрофлоры кишечника на уровне филумов и родов. Продемонстрировано увеличение соотношения Firmicutes/Bacteroidetes у пациенток с НГЭ, что согласуется с результатами ранее выполненных работ [17]. Согласно литературным данным, соотношение Firmicutes/Bacteroidetes определяется как важный прогностический фактор ряда метаболических и воспалительных патологий, в частности таких, как ожирение [18], сахарный диабет 2-го типа [19] и синдром раздраженного кишечника [20].

Между тем в вопросе особенностей родового и видового состава микробиоты при эндомериозе до сих пор нет единого мнения. Ряд авторов указывают на увеличение представителей Proteobacteria, Actinobacteria, Cyanobacteria, Saccharibacteria, Fusobacteria, Acidobacteria и Patescibacteria [21][22]. L. Huang с соавт. демонстрируют повышение численности Eggerthellalenta и Eubacteriumdolichum на фоне уменьшения Clostridia, Ruminococcus и Lachnospiraceae [23]. В. Ata с соавт. отмечают значимое снижение представленности родов Sneathia, Barnesella и Gardnerella [24]. В ходе нашего исследования у пациенток с НГЭ установлено статистически значимое повышение численности родов Lachnospira, Blautia, Dorea, Streptococcus, Eubacterium рallii_group и достоверное снижение Bifidobacterium и Eubacterium eligens_group. Указанные микроорганизмы обладают выраженным иммуномодулирующим потенциалом, регулируют проницаемость кишечного барьера, продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты и другие метаболиты.

В контексте полученных результатов особое внимание привлекают бактерии рода Streptococcus. В ранее выполненной работе J. Biarc с соавт. отмечают увеличение представленности указанного таксона у пациентов с дисбактериозом [25]. Кроме того, авторы демонстрируют, что токсичный белок, выделяемый некоторыми представителями рода Streptococcus, обладает провоспалительным действием, которое опосредовано активацией циклооксигеназы второго типа (ЦОГ-2) и сверхэкспрессией простагландина E2 (ПГЕ2) [26]. Последний, в свою очередь, является медиатором тканевого воспаления, повышает чувствительность ноцицептивных рецепторов и регулирует направление иммунных реакций.

Значимым достижением представленного исследования является также расширение представлений о взаимосвязи микрофлоры кишечника с показателями гормонального и иммунного статуса у пациенток с НГЭ. Общеизвестно, что для женщин с эндометриозом характерен высокий уровень эстрогенов в крови [6]. 17β-эстрадиол (E2) является ключевым гормоном, который опосредует разрастание эндометриоидной ткани, а также усиливает воспаление и болевые ощущения, связанные с ней [27]. Считается, что это локальное накопление эстрогена играет важную роль в развитии и прогрессировании эндометриоидных очагов путем связывания и активации эстрогеновых рецепторов (англ. estrogen receptors, ER) ERα и ERβ. Перекрестное взаимодействие ERα и IL-6 опосредует ранний дебют эндометриоза [28]. Показано, что макрофаги со сверхэкспрессией ERβ в эктопическом эндометрии активно секретируют провоспалительные цитокины TNF-α и IL-8, которые, в свою очередь, являются мощными индукторами ангиогенеза и пролиферации очага поражения [29].

Предыдущие исследования показали, что микробиота кишечника может влиять на системный уровень эстрогена [11]. Частично метаболизированный эстроген выводится с желчью и в конечном итоге попадает в кишечник. Микрофлора кишечника играет важную роль в реабсорбции активных гормонов ферментативными и другими путями [16]. В своей работе М. Leonardi с соавт. указывают, что ряд бактерий, продуцируя β-глюкуронидазу и β-глюкозидазу, способствуют распаду эстрогена, усиливая реабсорбцию его свободной формы и повышая концентрацию указанного гормона в крови [30]. В нашем исследовании также отмечено, что численность бактерий родов Eubacterium hallii_group и Streptococcus положительно коррелирует с уровнем эстрогена у пациенток с НГЭ, что косвенно указывает на вовлеченность дисбиотических изменений кишечника в развитие эндометриоза.

Согласно данным имеющихся публикаций, микрофлора кишечника способна вступать в метаболические взаимодействия с цитокинами, секретируемыми в эндометриоидных очагах, периферической крови и перитонеальной жидкости [31]. Показано, что связь между кишечной микробиотой и цитокиновым профилем – двусторонний процесс, точные механизмы которого нуждаются в дополнительном изучении. Между тем J. Cai с соавт. отмечают, что повышенная проницаемость кишечника и выход продуктов метаболизма бактерий может способствовать изменениям функциональной активности макрофагов в брюшной полости [32]. Кроме того, перитонеальные макрофаги способны усиливать секрецию провоспалительных цитокинов при стимуляции липополисахаридами, опосредуя развитие воспалительной инфильтрации, пролиферации и неоангиогенеза, наблюдаемых при НГЭ [33].

Результаты нашего исследования показали, что уровень TNF-α у пациенток с НГЭ был повышен, а также значимо отрицательно коррелировал с обилием Streptococcus и Lachnospira и имел положительную связь с численностью рода Bifidobacterium. Также установлена статистически значимая корреляция между концентрацией сывороточного IL-8 и представленностью Streptococcus. Выявленные взаимосвязи указывают на тесную связь кишечного дисбиоза с сигнальным путем RIG-I-подобного рецептора (англ. RIG-I-like receptor, RLR). Этот путь после активации может инициировать транскрипцию генов-мишеней ядерного фактора NF-kB (англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), включая те, которые связаны с воспалительной реакцией (IL-6, IL-8 и TNFα) [34][35].

Таким образом, представленные результаты текущего исследования подтверждают важное значение микробиоты кишечника в патофизиологии НГЭ.

Заключение / Conclusion

Установлена связь дисбиотических изменений кишечника с развитием эндометриоза. Выявленные корреляции нарушений таксономического состава кишечной микрофлоры с показателями гормонального и иммунного статуса у пациенток с НГЭ указывают на вовлеченность микробиоты кишечника в патофизиологию эндометриоза. Имеющаяся фрагментарность знаний по данному вопросу указывает на актуальность продолжения исследований в направлении установления потенциальных механизмов влияния микробиоты кишечника на нейро-гуморально-иммунную ось у пациенток с НГЭ.