Антифосфолипидные антитела как потенциальный фактор прогрессии опухоли

Введение / Introduction

Современные общепринятые клинико-лабораторные критерии антифосфолипидного синдрома (AФС) хорошо известны и включают сосудистый тромбоз и осложнения беременности у пациентов с циркуляцией антифосфолипидных антител (АФА) – волчаночного антикоагулянта (ВА), высокие титры антител к кардиолипину (англ. anti-cardiolipin antibodies, aCL) и β₂-гликопротеину 1 (англ. anti-β₂-glycoprotein 1 antibodies, anti-β₂-GР1). Сосудистый тромбоз может быть артериальным, венозным или сосудов мелкого калибра в любых тканях или органах и должен быть объективно подтвержден визуализацией или гистопатологией. Заболевания сердечных клапанов, сетчатое ливедо, тромбоцитопения и нефропатия являются некритериальными клиническими проявлениями АФС, которые могут проявляться изолированно или в сочетании с тромбозом и/или заболеваемостью во время беременности. Рецепторы АФА в большом количестве находятся во многих органах и тканях, что обуславливает такую разнообразную клиническую картину АФС.

Хотя АФА в первую очередь связаны с АФС, они не являются специфичными исключительно для AФС; циркуляцию АФА можно найти у здоровых людей, у пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями, с инфарктом миокарда, инсультом, мигренями. В последние нескольких лет стали говорить и о взаимосвязи АФА и рака: повышенные уровни и высокая распространенность АФА были обнаружены при различных злокачественных новообразованиях [1].

По данным мировой литературы, циркуляция АФА у онкологических больных варьирует от 15 до 74 %. Такой значительный разброс обусловлен отчасти различиями в дизайне исследований и непоследовательными определениями «АФА-позитивности» [2][3]. Кроме того, различия в распространенности АФА в популяции онкологических больных могут быть обусловлены различиями в клинических характеристиках включенных в исследование онкологических пациентов. Например, проспективное исследование недавно диагностированных амбулаторных больных раком, получающих химиотерапию, продемонстрировало, что АФА встречались у 18,7 % онкологических больных, стойкая циркуляция АФА через 12 нед сохранялась у 14,6 %. При этом наличие АФА в 3,6 раз повышало риск артериальных и венозных тромбозов у амбулаторных онкологических пациентов [4]. Однако исследование тяжелых онкобольных, находившихся более 48 ч в отделении интенсивной терапии, показало, что частота циркуляции АФА составила 74 % [5].

Точные механизмы, ответственные за продукцию АФА у больных раком, еще полностью не изучены, однако было предложено несколько гипотез, объясняющих у них наличие АФА [6]:

1) выработка аутоантител иммунной системой в ответ на опухолевые антигены. Опухолевые клетки могут продуцировать измененные или мутировавшие белки (неоантигены), которые иммунная система распознает как чужеродные. В отличие от ассоциированных с опухолью антигенов, которые в избытке экспрессируются раковыми клетками и могут присутствовать в нормальных тканях, неоантигены являются исключительно опухолеспецифичными, не кодируются зародышевой линией и распознаются адаптивной иммунной системой как чужеродные эпитопы. Открытие неоантигенов опухоли и определение их приоритетности является неотъемлемой частью продвижения следующего поколения методов иммунотерапии рака. Некоторые исследования предполагают, что эти опухолевые неоантигены могут иметь сходство с фосфолипидсвязывающими белками, приводя к образованию АФА [7][8];

2) секреция АФА непосредственно опухолевыми клетками; нарушение регуляции иммунного ответа. Рак может нарушить хрупкий баланс иммунной системы, приводя к выработке антител против собственных антигенов, таких как фосфолипиды [9]. Это нарушение регуляции может быть результатом хронического воспаления, иммунной дисфункции или вызванных опухолью изменений активности иммунных клеток;

3) распространение или перемещение эпитопа, когда иммунная система меняет направление на другие эпитопы, отличные от первичного. В некоторых случаях антигены, ассоциированные с раком, могут вызывать иммунный ответ против нормальных антигенов. Это явление, известное как распространение эпитопа, может привести к выработке антител против фосфолипидсвязывающих белков.

Как известно, АФА проявляют различную биологическую активность. Многочисленные экспериментальные модели рака молочной железы (РМЖ) in vivo продемонстрировали, что введение IgG АФА, полученные у пациентов с аутоиммунным заболеванием, быстро ускоряет ангиогенез опухоли и последующую прогрессию опухоли, особенно при медленно растущих бессосудистых опухолях. Действие АФА было локальным по отношению к участку опухоли и вызывало лейкоцитарную инфильтрацию и инвазию опухоли. Опухолевые клетки, обработанные АФА-положительным IgG, экспрессировали множество проангиогенных генов, включая фактор роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor, VEGF) [10], тканевой фактор (англ. tissue factor, TF) и колониестимулирующий фактор 1 (англ. colony stimulating factor 1, CSF1) [11]. Повышая проницаемость сосудов, аутоантитела к антифосфолипидам способны увеличивать утечку протонов через внутреннюю мембрану митохондрий и снижать способность АТФ-азы продуцировать АТФ, приводя к некрозу [12]. В митохондриях электроны, проходящие через систему переноса электронов, перемещают протоны через внутреннюю мембрану митохондрий и тем самым создают электрохимический градиент, который используется для синтеза АТФ [9]. Неизбежно происходит некоторая утечка электронов, и их последующая реакция с кислородом приводит к образованию реактивных форм кислорода (англ. reactive oxygen species, ROS) в виде супероксида (O₂⁻) [13]. АФА взаимодействуют с митохондриями, индуцируя выработку оксида азота (NO) и ROS, способствуя окислительному стрессу и, в конечном счете, образованию опасных внеклеточных везикул (англ. extracellular vesicles, EVs) [14].

Ранее EVs рассматривали как «мешки для мусора» для удаления клеточных компонентов. Они легко обнаруживаются в различных жидкостях организма, включая кровь, мочу и слюну, и могут служить отличным биомаркером для мониторинга возникновения, прогрессирования и прогноза рака, а также для прогнозирования эффективности схем лечения. EVs способствуют различным стадиям метастазирования рака, таким как стимулирование ангиогенеза, модуляция иммунной системы и формирование преметастатической ниши [15][16]. Исследования in vitro демонстрируют значительное повышение уровня эндотелиальных EVs после стимуляции эндотелиальных клеток антифосфолипидными антителами [14].

Многие опухолевые клетки продуцируют TF, который является центральным фактором каскада свертывания и может стимулировать ангиогенез либо посредством прокоагулянтной функции и активации тромбоцитов, либо альтернативно, путем прямой активации активируемого протеазой рецептора-2 (англ. protease-activated receptor-2, PAR2) и проангиогенной передачи сигналов в эндотелиальных клетках [17]. Экспериментальные модели на животных показали, что АФА обладают потенциальными проонкогенными свойствами, которые опосредуются тканевым фактором. АФА активируют экспрессию проангиогенных генов в клетках опухоли, индуцируют TF-зависимую васкуляризацию в небольших, медленно растущих бессосудистых опухолях и способствуют прогрессированию опухоли на нескольких мышиных моделях РМЖ; т. е. TF, полученный из опухолевых клеток, в присутствии АФА способствовал быстрому прогрессированию опухоли по сравнению с образцами без присутствия АФА [11].

Помимо влияния на стимуляцию ангиогенеза и прогрессирование опухоли, TF является мощным прокоагулянтом, повышающим риск тромбоэмболических осложнений (ТЭО) у больных раком [17]. Тромбоз является одним из самых грозных осложнений онкологического процесса и занимает второе место среди всех причин летальных исходов [18]. TF, продуцируемый злокачественными клетками, по-видимому, запускает каскад свертывания, приводящий к образованию фактора Ха (FXa), в то время как некоторые раковые клетки могут продуцировать противораковый прокоагулянт, который действует непосредственно на FXa.

В дополнение к потенциальному прокоагулянтному эффекту раковых клеток, некоторые виды противоопухолевой терапии могут быть дополнительной причиной рак-ассоциированного тромбоза. Было обнаружено, что различные химиотерапевтические препараты, включая метотрексат, циклофосфамид, цисплатин, доксорубицин, 5-фторурацил и леналидомид, связаны с шестикратным повышенным риском венозных тромбоэмболических осложнений (ВТЭО) и значительно повышают риск смертности [19]. Другие причины включают общую реакцию организма на опухоль, использование центральных венозных катетеров, венозный застой из-за сдавления кровеносных сосудов опухолью и длительную иммобилизацию онкологических больных в критическом состоянии [20]. Наличие же АФА может усиливать этот риск или может быть одной из причин тромбозов, ассоциированных с опухолью [21].

Кроме того, злокачественные новообразования могут являться причиной неспровоцированного тромбоза. Почти у 10 % пациентов с идиопатическим тромбозом в течение следующих 5–10 лет после первоначального диагноза тромбоза могут быть диагностированы онкологические заболевания. Эта ассоциация хорошо известна еще со времен Армана Труссо, который в 1865 г. описал наличие мигрирующих тромбофлебитов у опухолевых пациентов [22][23].

Некоторые авторы отмечают, что онкологические пациенты с повышенным титром АФА, в основном с высокими титрами, больше подвержены ТЭО [24]. Высокие титры либо IgG, либо IgM изотипов были обнаружены у 10 из 13 АФА-позитивных онкологических больных с ТЭО по сравнению с 2 из 34 АФА-положительных онкологических пациентов без ТЭО (р < 0,0001) [25].

Цель: определение профиля АФА у больных со злокачественными новообразованиями женской репродуктивной системы, выявление ассоциации АФА с тромбозами, степенью прогрессирования заболевания и исходом.

Материалы и методы / Materials and methods

Дизайн исследования / Study design

Проведено одноцентровое наблюдательное исследование с участием 130 женщин, из которых основную группу составили 70 пациенток с онкогинекологическими заболеваниями. Контрольную группу составили 60 практически здоровых женщин. Сбор клинического материала проводился с 2021 г. по 2023 г. на базе ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Средний возраст всей когорты обследованных женщин составил 56,0 [ 47,0; 63,0] лет. У всех пациентов основной группы при гистологическом исследовании выявлена аденокарцинома.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в основную группу: возраст от 18 до 75 лет; подтвержденный диагноз аденокарциномы шейки, тела матки и аденокарциномы яичников по данным клинико-лабораторных, инструментальных и морфологических исследований; пациенты с тромботическими осложнениями в анамнезе; комплаентность и подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения из основной группы: молодой (младше 18 лет) или пожилой (старше 75 лет) возраст; другие типы онкогинекологического рака; тяжелая сопутствующая патология, которая может повлиять на результат исследования; психические заболевания; беременность; нежелание продолжать участвовать в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: практически здоровые женщины без диагностированного онкологического заболевания и без тромботического анамнеза в возрасте от 18 до 75 лет; подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения из контрольной группы: отказ от участия в исследовании.

Методы исследования / Study methods

На первом этапе проводился сбор анамнеза (онкологический, соматический, семейный, акушерско-гинекологический, тромботический). Поскольку большинство всех случаев рака эндометрия, рака шейки матки и яичников являются аденокарциномами, в исследование были включены женщины только с гистологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы. Рутинное лабораторное исследование включало общий анализ крови, биохимическое исследование крови, показатели гемостаза – содержание фибриногена, протромбина и D-димера, протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), международное нормализованное отношение (МНО), тромбиновое время. Материалом для исследования служили образцы плазмы, полученные в первый день госпитализации в ФГБУ РНЦРР Минздрава России (до начала терапии). Инструментальная диагностика включала компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки и брюшной полости, ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза, рентгенографию органов грудной клетки, магнитно-резонансную томографию (МРТ) органов малого таза. По данным КТ, рентгенографии и УЗИ оценивали степень распространенности онкологического процесса и анатомические особенности пациента, а результаты МРТ отражали степень метастазирования онкогинекологического заболевания. Оценку состояния сосудов и вен нижних конечностей с целью выявления тромбов, определение скорости кровотока и других характеристик осуществляли с помощью ультразвуковой доплерографии (УЗДГ) нижних конечностей.

В дальнейшем образцы плазмы всех участниц исследования были протестированы на наличие АФА. Диагностика АФА включала в себя определение изотипов IgG/IgM традиционных критериальных антител к кардиолипину и к β₂-GР1, а также некритериальных антител к фосфатидилсерин-протромбиновому комплексу (англ. anti-phosphatidylserine-prothrombin complex antibodies, anti-PS-PT) и аннексину V. Определение АФА проводили иммуноферментным методом (ИФА) с помощью коммерческих наборов (Orgentec Diagnostica GmbH, Германия). Определение ВА было основано на удлинении времени свертывания с использованием яда гадюки Рассела (англ. dilute Russel’s viper venom time, dRVVT), производитель CoaDATA 4004 (Германия).

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проведено в соответствии с этическими стандартами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и ее последующими изменениями. До включения в исследование пациенты давали свое устное и письменное согласие. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Сеченовского Университета, протокол № 10-21 от 17.06.2021.

Статистический анализ / Statistical analysis

Вычисляли абсолютные и относительные частоты (% от общего числа наблюдений), медианы с интерквартильным интервалом (Ме [Q₂₅; Q₇₅]).

Формализация и формирование собранных клинических данных выполнялась на базе электронной таблицы Microsoft Excel. Обработка статистических данных проводилась с использованием программного обеспечения SPSS для Windows, версия 26.0 (SPSS, США). Для определения статистической значимости различий средних величин использовали U-критерия Манна–Уитни. Для выявления статистической значимости сравниваемых признаков использовали однофакторный дисперсионный анализ с расчетом точного критерия Фишера или критерий χ² с поправкой на правдоподобие в зависимости от количества сопряжённых признаков. Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

В исследовании приняли участие в общей сложности 130 человек, включая 70 онкологических больных основной группы и 60 здоровых женщин контрольной группы, соответствующих по возрасту (табл. 1, 2).

Общая характеристика участниц исследования представлена в таблице 2. Не было статистических различий по возрасту и индексу массы тела (ИМТ) в обеих группах.

В основной группе было статистически значимо больше (p < 0,002) женщин в менопаузе (табл. 3).

Отмечено статистически значимое увеличение значений АЧТВ (табл. 4) у онкогинекологических пациенток по сравнению со здоровыми женщинами (р = 0,004), что связано с циркуляцией АФА в основной группе.

Проведено сравнение пациенток с онкологической патологией со здоровыми женщинами по наличию АФА (табл. 5). У 24 (34,28 %) пациенток основной группы была выявлена циркуляция АФА. В 20 случаях это были низкие титры АФА и в 4 случаях – высокие титры. Из них антитела к β₂-GР1 изотипа IgG были обнаружены у 6 пациенток, антитела к β₂-GР1 изотипа IgM – у 4 женщин с онкогинекологическим диагнозом; aCL IgG встретились у 1 пациентки, aCL IgM – у 8; антитела к аннексину V IgG – у 10, IgM – также у 10 пациенток; антитела к PS-PT IgG – у 4, IgM – у 4 пациенток. В контрольной группе АФА были обнаружены у 4 (6,7 %) женщин: антитела к β₂-GР1 IgM – у 2, антитела к β₂-GР1 IgG – у 2, антитела к аннексину V IgM – у 2 обследованных.

Таблица 5. Циркуляция антифосфолипидных антител.

Table 5. Antiphospholipid antibodies level.

Примечание: выделены значимые различия между группами.

Note: significant inter-group differences are highlighted.

У 10 (14,2 %) из 70 женщин основной группы в анамнезе были тромбозы (9 случаев венозного тромбоза и 1 артериальный тромбоз): 1 – тромбоз глубоких вен (ТГВ) левой голени, гетерозиготная форма мутации в гене фактора V Лейден; 2 – илеофеморальный тромбоз слева, из сопутствующих заболеваний – цирроз печени, псориаз; 3 – тромбоз подколенных артерий, циркуляция ВА, гетерозиготная форма мутации в гене фактора V Лейден; 4 – тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), циркуляция aCL изотипа IgM, антитела к PS-PT изотипов IgG и IgM; 5 – тромбоз параметральных вен, циркуляция антител к β₂-GР1 изотипа IgM; 6 – ТГВ левой голени после химиотерапии; 7 – ТЭЛА после хирургического вмешательства; 8 – илеофеморальный тромбоз, циркуляция anti-β₂-GР1 изотипа IgM; 9 – катетер-ассоциированный тромбоз, антитела к PS-PT изотипа IgM и к аннексину V изотипа IgG; 10 – тромбоз параметральных вен.

Обращает на себя внимание, что у 5 из 10 женщин с отягощенным тромботическим анамнезом наблюдалась циркуляция АФА. В одном случае тромбоза у АФА-позитивной онкобольной был выявлен высокий титр АФА. В 3 случаях наблюдался низкий титр АФА, однако имела место одновременная циркуляция двух видов антител – к кардиолипину и PS-PT, либо к PS-PT и к аннексину V. У пятой пациентки были выявлены циркуляция АФА и гетерозиготная мутация в гене FV Лейден. Изолированная циркуляция АФА была выявлена лишь у 4 женщин с тромбозами. Статистически значимых различий между онкологическими пациентками с тромбозами и без тромботических осложнений в анамнезе выявлено не было (табл. 6).

Обращает на себя внимание выявленная статистически значимая взаимосвязь между циркуляцией aCL (IgG, IgM) и антител к PS-PT (IgG, IgM) и стадией онкологического процесса у пациенток основной группы (табл. 7).

Исследование влияния АФА на рецидив заболевания (табл. 8) показал значимую взаимосвязь с уровнем антител к кардиолипину изотипа IgM (p = 0,017).

С целью выявления предикторов среди оцениваемых показателей (АФА), оказывающих значимое влияние на безрецидивную выживаемость больных с раком, проведен многофакторный анализ с использованием модели пропорциональных рисков (регрессия Кокса). В таблице 9 представлены показатели отношения рисков, полученные при использовании модели пропорциональных рисков Кокса.

Сформированная модель не имеет статистической значимости (р = 0,078). Также исследованные факторы не повлияли на безрецидивную выживаемость больных с онкологическими заболеваниями.

Заключение / Conclusion

Хорошо известна патогенетическая роль АФА в развитии тромбозов и акушерских осложнений. Однако весьма ограничено количество исследований, посвященных распространенности и роли АФА у больных с аденокарциномой шейки матки, тела матки и аденокарциномой яичников. Наши результаты показывают, что умеренные или низкие титры АФА присутствуют у большого числа пациентов (34,2 %) с раком тела матки, шейки матки и раком яичников, что указывает на специфическую связь с онкогинекологическими опухолями. Как известно, пациенты с активными злокачественными новообразованиями подвержены высокому риску развития венозных и артериальных тромбозов, и в начале исследования мы предполагали, что циркуляция АФА является одним из факторов, который увеличивает этот риск. Однако мы не обнаружили достоверной взаимосвязи между циркуляцией АФА и развитием тромбозов у данных онкобольных. Не было выявлено статистически значимых различий между онкогинекологическими пациентками с тромбозами и без тромботических осложнений у женщин с онкогинекологическим раком. Возможно, это связано с тем, что в большинстве случаев определялся низкий титр АФА. Другой причиной может быть определение только изотипов IgG и IgM, но не изотипа IgA, наличие которого строго коррелирует с тромбозами.

Также по результатам нашего исследования АФА не оказали влияния на безрецидивную выживаемость пациенток с онкогинекологическим раком. Однако обращает на себя внимание выявление статистически значимой взаимосвязи между циркуляцией АФА и степенью онкологического процесса: наличие aCLs изотипов IgG и IgM и антител к PS-PT изотипов IgG и IgM было ассоциировано с более тяжелой степенью опухолевого процесса. Кроме того, была обнаружена значимая связь уровня антител к кардиолипину изотипа IgM с рецидивом заболевания, что указывает на возможную патогенетическую роль АФА как потенциального фактора риска развития или прогрессирования рака шейки матки, тела матки и яичников. Поскольку связь АФА с тромбозами хорошо известна, основные исследования патологического влияния АФА при раке в основном сосредоточены на ТЭО, которые распространены при многих злокачественных новообразованиях. Хотя тромбозы и являются визитной карточкой АФС, помимо острого тромбоза АФС-пациенты демонстрируют другие нетромботические проявления (сетчатое ливедо, гемолитическая анемия, когнитивная дисфункция, хорея, судороги, пороки клапанов сердца, окклюзионная васкулопатия, легочная гипертензия, нефропатия, тромбоцитопения и др.), которые реализуются через активацию моноцитов, тромбоцитов, эндотелиальных клеток, систему воспаления, формирование внеклеточных ловушек нейтрофилов. Возможно, АФА являются специфичным для пациента фактором, способствующим ангиогенному переключению опухоли и, как следствие, инвазии и прогрессии опухоли.

Необходимы дальнейшие крупномасштабные исследования, чтобы установить, могут ли антитела к фосфолипидам использоваться в качестве диагностического инструмента при онкогинекологических заболеваниях для выявления пациентов с риском прогрессирования заболевания, рецидива рака и риска развития ТЭО.