Протеомика материнской крови при реализации рецидива ранней преэклампсии

Введение / Introduction

Во всем мире 10–15 % всех случаев материнской смертности могут быть связаны с преэклампсией (ПЭ) и/или другими плацентарным заболеваниями [1]. В тяжелых случаях ПЭ приводит к жизнеугрожающим состояниям – эклампсии, HELLP-синдрому, преждевременной отслойке плаценты, и именно с ранней ПЭ (рПЭ) связаны фетальные осложнения, такие как задержка роста плода, респираторный дистресс-синдром новорожденных и мертворождение [2]. Как известно, рецидив рПЭ регистрируется в диапазоне от 5 до 65 % [3][4], в связи с чем поиск эффективных маркеров прогнозирования риска рецидива рПЭ – одно из приоритетных направлений развития акушерской науки. Учитывая гетерогенный, полисистемный характер поражения при рПЭ, маловероятно, что какой-либо отдельный протокол скрининга, содержащий небольшую группу биомаркеров, может обладать необходимой специфичностью и чувствительностью для точного прогнозирования рецидива рПЭ [5]. Особый интерес представляют биологически активные вещества, экспрессируемые эндотелием, дисфункция которого сохраняется длительное время после родоразрешения с тяжелой ПЭ [6]. Так, например, профессор Н.И. Фадеева с соавт. еще в 2001 г. показали ценность определения фактора фон Виллебранда (англ. von Willebrand factor, vWF) у женщин, беременность которых осложнилась ПЭ, а также наличие взаимосвязи влияния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза на здоровье новорожденных [7]. В это же время S. Nishikawa с соавт. определили, что уровень эндотелина-1 (ЭТ-1) в сыворотке крови беременных с ПЭ выше, чем у здоровых беременных (p < 0,001) [8]. Исследователи из Винницы получили аналогичные данные [9]. Ученые из Индонезии под руководством M.K. Simanjuntak определили, что уровень ЭТ-1 в периферической крови у беременных с ПЭ выше, чем у женщин с физиологическим течением гестации (p < 0,05); также ими определена положительная корреляция между ЭТ-1 и средним артериальным давлением (r = 0,34; р < 0,05) [10]. Незначительное количество работ посвящено исследованию металлопротеиназы ADAMTS-13 (англ. a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif, member 13) в группе риска развития ПЭ [11][12]. Чаще изучение данного маркера связано с работами по тромботической микроангиопатии (ТМА), где ADAMTS-13 рассматривается как протеиназа vWF [13]. Но как известно, рПЭ позиционируется исследователями именно как вторичная ТМА [14][15], и исследование показателей сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, а именно, соотношения по оси ADAMTS-13/vWF представляет особый интерес.

Цель: изучить вклад эндотелиальных белков материнской крови в реализацию рецидива рПЭ.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

В рамках проспективного когортного исследования проведен протеомный анализ периферической крови 137 беременных в 3 точках – в 11–13, 19–21 и 27–28 нед беременности. Набор клинического материала осуществлен в родовспомогательном стационаре 3 уровня.

Группы обследованных / Patient groups

По окончанию беременности были выделены следующие клинические группы (рис. 1): группа контроля (40 женщин с физиологическим течением наблюдаемой и предыдущей беременности и срочными родами); группа наблюдения с рПЭ, включавшая группу сравнения (59 пациенток с рПЭ в анамнезе, но физиологическим течением настоящей гестации) и основную группу (38 пациенток с рецидивом рПЭ). Важно уточнить, что пациентки основной группы и группы сравнения принимали ацетилсалициловую кислоту согласно клиническим рекомендациям [16].

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в группу наблюдения: возраст 18–35 лет; одноплодная беременность; рПЭ в анамнезе либо рецидив рПЭ; подписанное информированное согласие.

Критерии включения в группу контроля: возраст 18–35 лет; отсутствие соматической и гинекологической патологии; согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: возраст менее 18 и более 35 лет; беременность, наступившая в результате экстракорпорального оплодотворения; многоплодная беременность; эпизоды тромбоза в личном анамнезе; экстрагенитальная патология, определяющая риск развития ПЭ; нежелание участвовать в исследовании.

Методы исследования / Study methods

Динамическому исследованию в 3 точках (в 11–13, 19–21 и 27–28 нед беременности) подлежали биологически активные вещества, свидетельствующие о нарушении функции эндотелия: значения ЭТ-1, активность ADAMTS-13, уровень vWF и концентрация гомоцистеина (ГЦ). Отдельно рассчитано и проанализировано соотношение значений ADAMTS-13/vWF.

Методом иммуноферментного анализа определяли в периферической крови женщин уровень ГЦ (Axis-Shield Diagnostics Ltd, Великобритания) и концентрацию ЭТ-1 (R&D Systems, США). Для измерения активности ADAMTS-13 использовали хромогенный тест TECHNOZYM^® ADAMTS-13 Activity ELISA (DiaPharma Group Inc., США), активности vWF – набор Rictocetin Cofactor Kit (Helena Biosciences Europe, Великобритания). Все тесты выполнены на сертифицированном оборудовании.

Этические аспекты / Ethical aspects

Все процедуры, выполненные в данном исследовании, соответствовали этическим стандартам Хельсинской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям и сопоставимым нормам этики. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и отбор биоматериала для анализа.

Исследование получило одобрение локального этического комитета ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России, протокол заседания № 9 от 29.11.2019.

Статистические методы / Statistical analysis

С целью определения нормальности распределения показателей лабораторных тестов в группах сравнения использовали критерий Шапиро–Уилка. Категориальные переменные описаны с использованием частоты (n) и удельного веса (%); непрерывные переменные описаны с использованием медианы (Ме), 95 % доверительного интервала (95 % ДИ) для медианы и интерквартильного размаха [ 25-й и 75-й перцентили]. Сравнение рядов выполняли с использованием непараметрических методов (U-тест Манна–Уитни). Для выявления взаимосвязи между риском рецидива рПЭ и несколькими независимыми переменными (показатели лабораторных тестов, отражающих функцию эндотелия) проведен множественный регрессионный анализ. Статистическую значимость устанавливали при p < 0,05 и определяли с помощью программного обеспечения MedCalc version 17.9.7 (MedCalc Software, Бельгия).

Результаты / Results

Клинические характеристики пациенток с реализацией рецидива рПЭ свидетельствуют о том, что в 20 (52,6 %) наблюдениях определены заболевания, не являющиеся факторами риска развития рПЭ, остальные 18 (47,8 %) женщин соматически здоровы (табл. 1).

При динамическом исследовании уровня ЭТ-1 установлено, что в точке 11–13 нед беременности, соответствующей окончанию первой волны инвазии трофобласта (рис. 2), медиана показателя у пациенток основной группы статистически значимо выше, чем у групп наблюдения (p < 0,0001) и контроля (p = 0,0003).

С увеличением срока гестации, в 19–21 нед уровень ЭТ-1 имел тенденцию к росту во всех группах и оставался статистически значимо выше в основной группе относительно групп сравнения (p = 0,0001) и контроля (p < 0,0001). Необходимо отметить, что прирост показателя в основной (1,07 пкмоль/л против 0,92 пкмоль/л) и контрольной (0,334 пкмоль/л против 0,391 пкмоль/л) группах был идентичен – на 16 и 14 % соответственно. В группе сравнения Ме показателя увеличилась на 22,2 % (0,534 пкмоль/л против 0,416 пкмоль/л), что не имело статистической разницы при сравнении в группах.

Анализ уровня ЭТ-1 в сроке гестации 27–28 нед определил увеличение медианы показателя в основной группе и группе сравнения: на 29 % (1,37 пкмоль/мл против 1,07 пкмоль/л) и на 47 % (1,00 пкмоль/мл против 0,534 пкмоль/мл) соответственно. Однако в группе женщин с физиологическим течением беременности уровень ЭТ-1 в 27–28 нед беременности, напротив, уменьшился, вернувшись к показателю в 11–13 нед гестации (рис. 2). При этом разница между основной группой и группой сравнения составила 1,36 раза (p = 0,0001), с группой контроля – 4,7 раза (p < 0,0001).

Далее были проанализированы показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свидетельствующие при их дисбалансе о нарушение функции эндотелия. При определении vWF в 11–13 и в 19–21 нед беременности его значения во всех группах определены как сопоставимые (рис. 3). Однако при исследовании показателя в 27–28 нед беременности, а именно в этом сроке в группе женщин с рецидивом рПЭ (основная группа) в 42,1 % случаев был установлен диагноз тяжелой ПЭ, уровень vWF у пациенток с рецидивом заболевания был статистически значимо выше, чем в группах контроля (p < 0,0001) и сравнения (p < 0,0001). Медиана значений vWF определена у пациенток основной группы в 1,8 раза выше, чем у женщин с рПЭ в анамнезе, но с благоприятным течением наблюдаемой беременности.

Интересные данные получены при анализе активности металлопротеиназы ADAMTS-13 в различные сроки гестации. Во всех группах отмечено снижение показателя со сроком гестации (рис. 4). При этом, несмотря на статистически различные показатели активности в 11–13 нед беременности в группах контроля и сравнения, снижение активности ADAMTS-13 идентично: на 31,9 % (с 85,3 до 55,3 %; р < 0,0001) и на 42,0 % (с 114,7 до 66,5 %; р < 0,0001) соответственно. В группе с рецидивом рПЭ определено снижение показателя по медиане всего на 16,1 % (с 63,4 до 53,2 %; р = 0,0001).

Также необходимо отметить, что максимальная активность металлопротеиназы во всех точках исследования определена в группе пациенток с рПЭ в анамнезе и с благоприятным течением настоящей беременности (группа сравнения). В основной группе с реализованным рецидивом рПЭ в первой точке исследования (11–13 нед гестации) определена минимальная активность ADAMTS-13, достоверно меньшая при сравнении с ее значением в группах контроля (р = 0,0007) и сравнения (р = 0,0001).

Принимая во внимание биологическое взаимодействие рассматриваемых маркеров повреждения эндотелия, представлялось целесообразным проанализировать ось ADAMTS-13/vWF. Как видно из рисунка 5, во всех группах происходило снижение соотношения по оси ADAMTS-13/vWF, при этом самые высокие его значения выявлены в группе сравнения. Учитывая, что снижение соотношения ADAMTS-13/vWF является основным маркером эндотелиопатии [17], становится объяснимым полученный результат у пациенток основной группы, в которой определены статистически значимо низкие значения во всех точках исследования как по сравнению с группой контроля, так и группой сравнения. При этом необходимо отметить, что именно в случае рецидива рПЭ наблюдали максимально выраженное снижение соотношения ADAMTS-13/vWF с увеличением срока гестации, а именно: в 2,36 раза (с 0,52 до 0,22; р < 0,0001) в группе контроля, в 1,76 раза (с 0,74 до 0,42; р < 0,0001) в группе сравнения и в 2,6 раза (с 0,39 до 0,15; р < 0,0001) в основной группе.

Учитывая, что сверхпороговый уровень ГЦ рассматривается как биомаркер дисфункции эндотелия по причине формирования оксидативного стресса, проанализирована динамика уровня данной аминокислоты в группах. Результаты анализа были предсказуемы, так как все пациентки принимали профилактические дозы фолиевой кислоты и/или минерало-витаминные комплексы во время беременности. Во всех группах происходило снижение показателя с течением беременности, и в сроки гестации 19–21 и 27–28 нед медианы значений ГЦ были сопоставимы во всех группах исследования (рис. 6). Однако в первой точке исследования (11–13 нед гестации) в группе пациенток с реализацией рецидива рПЭ (основная группа) уровень ГЦ хотя и находился в пределах референсных значений к сроку гестации [18], все же был значимо бóльшим относительно и группы контроля (р < 0,0001) и группы сравнения (р = 0,0232).

Для определения потенциального вклада выявленных изменений по уровню и концентрации биомаркеров, определяющих повреждение эндотелия, проведен множественный регрессионный анализ по каждой точке динамического исследования (табл. 1). В качестве зависимой переменной выбран рецидив рПЭ при наблюдаемой беременности. Независимые переменные сохранялись в модели путем пошагового выключения при отсутствии статистически значимого влияния на зависимую переменную (рецидив рПЭ).

Согласно проведенному анализу, в сроке гестации 11–13 нед все проанализированные биомаркеры вносят вклад в реализацию рецидива рПЭ, определяя при суммарном воздействии 62,3 % риска. При беременности 19–21 нед ГЦ как фактор риска утрачивает свое значение. Дисбаланс по оси ADAMTS-13:Ас/vWF:Ag (активность ADAMTS-13/антиген vWF) в ассоциации с повышением активности ЭТ-1 определяют риск рецидива заболевания в 65,6 % случаев. В сроке гестации 27–28 нед определено 3 биомеркера – ЭТ-1, vWF и ADAMTS-13, сопряженный сдвиг которых определяет 67,9 % риска.

Обсуждение / Discussion

Идентификация биомаркеров играет решающую роль в персонализированной медицине как в клинических, так и в исследовательских условиях. На конгрессе Международного общества по тромбозам и гемостазу (англ. International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH) в 2022 г. было установлено, что ЭТ-1 и эндотелиальные микровезикулы являются потенциальными предикторами рецидива рПЭ [19]. Результаты представленного нами исследования полностью соответствуют заявленному на конгрессе утверждению: уровень ЭТ-1 во всех точках исследования у пациенток с рецидивом рПЭ был статистически значимо выше, чем у женщин с благоприятным течением беременности. При этом необходимо отметить, что роль других эндотелиальных протеинов в патогенезе и реализации рецидива рПЭ до настоящего времени является предметом научных дискуссий. Наиболее доступен для изучения vWF, и многочисленные исследования демонстрируют статистически значимое увеличение этого показателя у беременных с ПЭ или HELLP-синдромом [20][21]. Так, например, по результатам исследования ученых из Египта, уровень антигена vWF в плазме был значительно выше при ПЭ по сравнению с группой при нормальном течении гестации, а также с небеременными (p < 0,01 для обеих групп). С целью прогнозирования риска сосудистых нарушений сетчатки у пациенток с ПЭ, О.В. Коленко с соавт. изучали взаимосвязи между биохимическими показателями эндотелиальной дисфункции и морфометрическими параметрами желтого пятна. Определено, что к III триместру беременности уровень vWF повышается, и в группе женщин с тяжелой ПЭ определяется статистически значимо выше, чем у здоровых беременных [22]. Представленные результаты согласуются с нашими как по срокам гестации, так и по кратности повышения vWF в плазме крови.

Исследования ранних лет демонстрируют неоднозначные выводы по изучению роли металлопротеиназы ADAMTS-13 во время беременности. Так, например, в 2007 г. команда ученых из Бельгии исследовала активность ADAMTS-13 в различных клинических ситуациях. Было определено, что физиологическая беременность сопровождается снижением активности ADAMTS-13 на 24,7 % [23]. В работе российских ученых установлено более выраженное снижение активности ADAMTS-13 при нормальной беременности – с 84,6 % в I триместре до 44,6 % в III, т. е. на 47,3 % [17], что согласуется с нашими результатами – в группе контроля активность ADAMTS-13 снизилась с 81,3 % в I триместре до 55,3% к 28 нед гестации, что составило 31,9 %.

Роль ADAMTS-13 в развитии ПЭ впервые показана группой ученых из Франции в проспективном исследовании «случай–контроль». Установлено, что низкие показатели активности ADAMTS-13 (≤ 70 %) были достоверно связаны с развитием ПЭ (отношение шансов (ОШ) = 4,2; 95 % ДИ = 1,1–15), причем эта связь не зависела от уровня vWF и факторов риска ПЭ. Авторы также предполагают количественное снижение белка при реализации ПЭ, а уменьшение активности ADAMTS-13 связывают с повышением уровня провоспалительных цитокинов – интерлейкина-6 и С-реактивного белка, специфичных маркеров ПЭ. Кроме того, в работе определено, что уровни активности ADAMTS-13 ≤ 57 % были достоверно ассоциированы с ранним началом ПЭ (OШ = 2,5; 95 % ДИ = 1,1–5,8) [24]. Другое заключение сделано A. Molvarec c соавт., которые не обнаружили разницы в активности ADAMTS-13 у беременных с ПЭ и здоровых беременных, при этом уровень vWF был значительно выше у пациенток с ПЭ [25]. По результатам нашей работы, активность ADAMTS-13 при развитии рецидива рПЭ определена достоверно ниже относительно группы контроля в сроке 11–13 нед, составляя по медиане 63,4 % (р = 0,0007). Возможно, снижение активности ADAMTS-13 можно рассматривать в качестве одного из факторов недостаточной инвазии синтициотрофобласта с последующим снижением маточно-плацентарного перфузионного давления и развитием ишемии плаценты [26].

Ось ADAMTS-13:Aс/vWF:Ag уже длительное время рассматривается как пара – кандидат на объяснение патофизиологии ПЭ [24][27][28]. Однако неоднозначность представленных результатов, скорее всего, обусловлена тем, что вмешивающихся факторов, действующих разнонаправленно и определяющих уровень vWF и активность ADAMTS-13 (ADAMTS-13:Ас), достаточно много. Пионерская работа российских ученых представила данные о соотношении ADAMTS-13:Aс/vWF:Ag у женщин с физиологическим течением гестации. В работе показано, что по мере увеличения срока беременности наблюдается прогрессивное снижение ADAMTS-13:Aс на фоне роста уровня vWF:Ag, что может являться признаком развития эндотелиопатии [17]. Наши данные совпадают с результатами коллег по части благоприятной беременности, при этом в случае реализации рецидива рПЭ смещение по оси ADAMTS-13/vWF более выражено в сторону уменьшения показателя: Ме = 0,39 в 11–13 нед и Ме = 0,15 в 27–28 нед гестации.

Заключение / Conclusion

Биологически активные протеины, экспрессируемые скомпрометированным эндотелием у пациенток с рПЭ в анамнезе вносят значимый вклад в реализацию рецидива заболевания. Наиболее значимым маркером, позволяющим прогнозировать риск рецидива заболевания и определяющим его развития в течение всей беременности, является ЭТ-1, а в сроки гестации 11–13 и 19–21 нед – отношение по оси ADAMTS-13/vWF.