Хемотранскриптомный анализ эффектов молекулы 7-гидроксиматаирезинола на опухолевые клетки молочной железы человека линии MCF7

Введение / Introduction

Лигнан 7-гидроксиматаирезинол (7ГМР), выделенный из стандартизированных экстрактов хвойных деревьев (ель, пихта белая, сосна и др.), характеризуется хорошей биоусвояемостью и безопасностью. 7ГМР оказывает мультитаргетное воздействие на систему иммунитета, способствуя контролю воспаления через сигнальные каскады TNF-α/NF-κB (фактор некроза опухоли альфа/ядерный фактор каппа B; англ. tumor necrosis factor alpha/nuclear factor kappa B), модуляцию метаболизма лейкотриенов и простагландинов [1][2]. Онкопротекторные свойства 7ГМР активно изучаются [1]. В эксперименте 7ГМР (120  мг/кг/сут) ингибирует рост карциномы Эрлиха, причём даже на фоне стимулирования пролиферативных процессов эстрогенами [3]. Хемореактомный анализ 7ГМР позволил предположить, что онкопротекторные свойства молекулы связаны с ингибированием гемоксигеназы, циклинзависимых киназ и ряда ростовых факторов [2].

Современный подход к изучению фармакологического действия лекарственных средств предполагает постгеномную парадигму, в рамках которой исследуются не только эффекты молекул на ингибирование тех или иных белков протеома, но и воздействие молекул на транскриптом, т. е. на уровни мРНК, характеризующие степень экспрессии генов (рис. 1) [4]. Тогда как ингибирование белков протеома соответствует «тактическим эффектам» лекарственных средств (несколько часов), транскриптомные данные об эффектах воздействия лекарства позволяют оценивать долговременные, «стратегические» эффекты их использования, измеряющиеся днями и неделями [5]. Оценка более длительных эффектов воздействия лекарственных средств имеет особое значение для длительно применяющихся онкопротекторных препаратов.

Цель: оценка транскриптомных эффектов лигнана 7ГМР по отношению к клеткам опухоли молочной железы.

Материалы и методы / Materials and Methods

Методика хемоинформационного исследования подробно описана в нашей предыдущей работе [6]. Так, для выбранного типа клеток (в случае настоящей работы – опухолевые клетки рака молочной железы, линия MCF7) и выбранного времени воздействия вещества на клетки (24 ч) в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) находятся выборки данных транскриптомных исследований. На основании применения теорий и алгоритмов комбинаторного анализа хемографов [7–9] осуществляется моделирование воздействия молекул на экспрессию генов в изучаемой клеточной линии. Затем разработанные и верифицированные кросс-валидацией модели применяются к дозозависимому анализу эффектов исследуемой молекулы (т. е. 7ГМР). В результате формируются 2 списка генов: (1) гены, экспрессия которых повысилась в результате воздействия изучаемой молекулы по сравнению с контролем («Список+»), и (2) гены, экспрессия которых снизилась («Список–»). К этим двум спискам генов применяются алгоритмы биоинформационного анализа, в частности, метода функционального связывания [4] с использованием международной номенклатуры Gene Ontology (GO) по биологическим ролям генов/белков.

Методы статистического анализа / Statistical analysis

Сравнение частот различных биологических ролей генов в двух списках осуществлялось с использованием критериев параметрической и непараметрической статистики (χ², t-критерий Стьюдента) в пакете программ ChemStudyY2 (Россия) для хемотранскриптомного анализа, разработанных на Вычислительном центре РАН.

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

Выделение групп генов с изменённой транскрипцией / Isolation of gene groups with altered transcription

Хемотранскриптомное изучение воздействия молекулы 7ГМР на клетки MCF7 (при 24-часовой экспозиции клеток) позволило выявить существенные изменения транскрипции (р < 0,05 по t-тесту; r = 0,50; величина изменений > 5 %/мкмоль 7ГМР) для 3468 из 12700 генов. При этом найдено снижение экспрессии («Список–») для 1387 генов и повышение экспрессии («Список+») для 2081 генов. Статистический анализ позволил выявить 56 GO-категорий функций 3468 генов, которые можно объединить в 6 групп, связанных с (1) деградацией белков на протеасомах, (2) процессами клеточной пролиферации, (3) рибосомальным биосинтезом белка, (4) поддержкой синтеза АТФ (энергетический метаболизм), (5) регуляцией вялотекущего системного воспаления и (6) собственно онкопротекторным действием (табл. 1, рис. 2). Очевидно, что экспрессия генов систематически снижается во всех группах, кроме группы «Онкопротекторное действие» (рис. 3), а частота встречаемости генов со сниженной экспрессией при воздействии 7ГМР («Список–») достоверно отличалась от частоты встречаемости генов с повышенной экспрессией при воздействии 7ГМР («Список+») (рис. 4).

Сравнение групп генов с изменённой транскрипцией посредством GO-категорий / Comparison of transcriptionally altered gene groups using GO categories

На рисунке 5 представлены количества генов списков «Список–» и «Список+», соответствующие GO-категориям в таблице 1. В целом, гены с повышенной экспрессией вследствие воздействия 7ГМР значимо отличаются по своим биологическим ролям от генов со сниженной экспрессией. Совместное рассмотрение профилей частот (рис. 3) и данных на рисунке 5 указывает на несомненное повышение уровней транскриптов генов с онкопротекторным действием на фоне снижения экспрессии генов из 5 остальных функциональных групп.

Молекулярно-физиологическая интерпретация результатов / Molecular and physiological interpretation of the results

Молекулярно-физиологическая интерпретация данных хемотранскриптомного анализа молекулы 7ГМР основана на 6 основных группах результатов:

A. снижение интенсивности внутриклеточного гомеостаза белков;

B. снижение экспрессии генов, вовлеченных в энергетический метаболизм;

C. снижение экспрессии генов, вовлечённых в онкопролиферацию;

D. снижение экспрессии генов, вовлечённых в хроническое воспаление;

E. повышение экспрессии онкопротекторных генов;

F. повышение экспрессии аскорбат-зависимых генов.

А. Снижение транскрипции генов синтеза белка (194 гена) и протеолиза белка (70 генов) указывает на общее снижение интенсивности белкового обмена под воздействием 7ГМР. Снижение синтеза белка, включая процессы сплайсинга мРНК и транспорта белков, указывает на уменьшение количеств ростовых факторов. Снижение протеолиза белков соответствует снижению хронического воспаления, регулируемого через сигнальный путь NF-κB, и активации апоптоза.

B. Снижение транскрипции генов энергетического метаболизма, включая белковые комплексы дыхательной цепи, цикла Кребса, пируватдегидрогеназы и других, указывает на уменьшение обеспеченности онкопролиферативных процессов молекулами АТФ посредством 7ГМР.

C. Снижение транскрипции онкопролиферативных генов (теломеры, репликации ДНК, клеточного цикла и прочих) соответствует уменьшению числа возможных делений опухолевых клеток и преодолению резистентности к химиотерапии [6] при воздействии 7ГМР.

D. Снижение транскрипции генов хронического воспаления способствует поддержке противовоспалительных эффектов 7ГМР на уровне протеома человека [1], в частности, ингибирование NF-κB за счёт торможения протеолиза киназы Iκ-B.

E. Повышение под воздействием 7ГМР транскрипции более 100 онкопротекторных генов затрагивает столь разнообразные процессы, как:

• снижение хемотаксиса нейтрофилов, способствующих прогрессии опухолей молочной железы [14], и повышение хемотаксиса Т-лимфоцитов, поддерживающих естественную онкопротекторную реакцию организма [15];
• активность сигнального пути интерферона, который стимулирует апоптоз опухолевых клеток [16];
• отрицательную регуляцию протеинкиназы В, что ингибирует рост опухолевых клеток MCF7 [17];
• отрицательную регуляцию ангиогенеза, что способствует замедлению роста опухолей;
• синтез тиреоидных гормонов, которые ингибируют рост и выживаемость опухолевых клеток, в том числе клеток линии MCF7 [18];
• хемотаксис эозинофилов, инфильтрация и дегрануляция которых внутри опухолей способствует разрушению последних [19];
• поддержку метаболизма витамина D, который является одним из важнейших онкопротекторных микронутриентов [20];
• повышение экспрессии рецептора ретиноидов RXR-α, регулирующего пролиферацию, дифференциацию и апоптоз клеток (активация рецептора RXR-αвызывает апоптоз опухолевых клеток MCF7 [21]);
• повышение экспрессии гена ABCC2, кодирующего канал-транспортер цисплатина и др.

F. Повышение транскрипции аскорбат-зависимых генов является важным аспектом воздействия 7ГМР, так как аскорбиновая кислота проявляет выраженные онкопротекторные свойства [22][23]. Анализ встречаемости белковых кофакторов (табл. 2) показал, что 7ГМР способствовал преимущественному снижению экспрессии генов, которые кодируют белки с такими кофакторами, как железо-серные кластеры [ 4Fe–4S] (15 генов; р = 0,0015), ионы магния (80 генов; р = 0,001), калий (6 генов; р = 0,014) и железо (4 гена; р = 0,045). Все перечисленные кофакторы играют важную роль в поддержании «клеточного дыхания» и энергетического метаболизма опухолевых клеток, так что снижение их экспрессии соответствует онкопротекторному действию. Кроме того, 7ГМР повышал транскрипцию генов, белки которых содержат аскорбат-анион в качестве кофактора (6 генов; р = 0,058). Частота встречаемости генов со сниженной экспрессией при воздействии 7ГМР («Список–») достоверно отличалась от частоты встречаемости генов с повышенной экспрессией при воздействии 7ГМР («Список+»).

Примеры дозозависимого изменения экспрессии генов под воздействием 7ГМР / Examples
of dose-dependent changes in gene expression upon exposure to 7HMR

В таблице 3 приведены отдельные примеры дозозависимого изменения экспрессии генов под воздействием 7ГМР, полученные в результате проведения хемотранскриптомного анализа молекулы.

Как было отмечено выше, 7ГМР может приводить к снижению экспрессии генов, вовлечённых в протеасомную деградацию белков (протеолиз). Например, снижалась экспрессия гена PSMB3, кодирующего субъединицу бета-3 протеасомы, и также гена UBE3C, кодирующего убиквитин протеин лигазу E3C, которая направляет белки на деградацию на протеасоме [24]. Снижение экспрессии гена CDCA3 (белок А3 цикла деления клеток) соответствует торможению деления клеток (митоза), так как данный белок опосредует убиквитинирование и деградацию WEE1-киназы в фазе G2/M клеточного цикла, тем самым инициируя митоз.

Хемотранскриптомный анализ показал, что 7ГМР снижает экспрессию генов, белки которых участвуют в пролиферации опухолевых клеток. Например, снижается экспрессия гена RUVBL1, который экcпреccируется во всех видах клеток. Ген RUVBL1 кодирует ДНК-геликазу – фермент под названием «RuvB-подобный белок-1», разъединяющий нити двойной спирали ДНК, которая участвует в транскрипционной активации генов. Белок RUVBL1 необходим для активации транскрипционных программ онкогенов и протоонкогенов, стимулирующих рост опухоли, а также для репарации ДНК. RuvB-подобный белок-1 играет существенную роль в онкогенной трансформации, вызываемой геном MYC, который принципиально необходим для пролиферации опухолевых клеток [25].

7ГМР может снижать экспрессию генов, белки которых участвуют в поддержании структуры теломер – концевых участков хромосом, которые укорачиваются в каждом цикле деления клетки, что является одной из важнейших причин биологического старения. Поддержание структуры теломер осуществляется теломеразой – ферментным комплексом, добавляющим специфическую последовательность ДНК к теломерам, тем самым стабилизируя хромосомы [26].

В частности, хемореактомный анализ 7ГМР указал на снижение экспрессии гена DKC1 (дискерин, необходим для биогенеза рибосома и поддержания теломер, пролиферации клеток [27]) и гена DCLRE1B (белок-1B перекрестного ремонта ДНК, осуществляющего поддержание и защиту теломер во время S-фазы клеточного цикла). Белок, кодируемый геном DCLRE1B, необходим для формирования теломерной петли (Т-петли), защищает теломеры от ферментов ремонта ДНК, от повреждения во время репликации при участии топоизомераз TOP1, TOP2A и TOP2B [28].

Под воздействием 7ГМР может снижаться экспрессия гена NHP2. Соответствующий этому гену рибонуклеопротеин NHP2 требуется для поддержания теломер, участвуя в модификациях и внутриядерном транспорте белка TERC – РНК-компонента обратной транскриптазы ферментного комплекса теломеразы [29]. Избыточная активация теломеразы наблюдается в 90 % всех раковых заболеваний человека [30], что указывает на важность этого механизма в формировании и развитии опухолевых заболеваний.

Хемореактомный анализ указал на повышение под воздействием 7ГМР экспрессии генов, подавляющих развитие опухолей: гена ITIH5 (ингибитор интер-α-глобулина H5, экспрессируется в молочных железах и яичниках, подавляет развитие опухолей), гена SLURP1 (белок SLURP1, поддерживает целостность слоев кератиноцитов [31], маркер поздней дифференциации кожи, обладает онкопротекторной активностью [32]), гена IFNAR2 (рецептор интерферонов альфа и бета, участвует в IFN-опосредованной активации сигнальных белков STAT1, STAT2 и STAT3 [33]) и гена SZT2 (белок SZT2, ингибирует активность mTORC1, участвует в регуляции mTORC1 глюкозой [34], играет роль в клеточном ответе на окислительный стресс [35]).

Полученные результаты указывают на дальнейшие перспективы исследований молекулы 7ГМР. Во-первых, необходимо установить, являются ли описанные изменения в транскрипции генов результатом воздействия 7ГМР на некоторые факторы транскрипции, которые одновременно являются таргетными белками для 7ГМР. Во-вторых, следует установить, являются ли описанные выше изменения транскрипции результатом изменения сигнального состояния клеток под воздействием 7ГМР.

Результаты хемотранскриптомного анализа указывают на реалистичные механизмы онкопротекторного действия 7ГМР. Состояние гиперэстрогении (например, при мастопатии) соответствует гиперпролиферативному профилю пациентки. Обычно считается, что 7ГМР якобы является «прямым антагонистом» эстрогенов. Однако прямых взаимодействий 7ГМР с рецепторами эстрогенов не было установлено. В то же время хемотранскриптомный анализ указал на целый комплекс физиологических свойств 7ГМР, которыми данная молекула противодействует проопухолевым свойствам эстрогенов (регуляция экспрессии более 100 генов онкопротекторного действия, 401 гена пролиферации клеток, 148 генов хронического воспаления и др.).

В экспериментальных и клинических исследованиях были продемонстрированы онкопротекторные свойства 7ГМР в условиях гиперэстрогении. Приём 120 мг/сут 7ГМР достоверно тормозил интенсивность роста опухолевых узлов на фоне гиперэстрогении у мышей с моделью карциномы Эрлиха [3]. В группе пациенток с фиброзно-кистозной мастопатией в постменопаузальном периоде (n = 60) были получены количественные оценки влияния приёма 7ГМР в режиме 60 мг/сут, 1 мес на показатели эстрогенового баланса. Приём 7ГМР способствовал нормализации метаболизма эстрогенов (снижение уровней эстрадиола, эстрона, эстриола, 16а-ОНЕ1) и улучшению клинической симптоматики мастопатии, тем самым снижая опухолевые риски, связанные с гиперэстрогенией [3].

Заключение / Conclusion

В настоящей работе представлены результаты хемотранскриптомного исследования воздействий 7ГМР на транскрипцию более 12 тыс. генов человека в линии опухолевых клеток MCF7 (рак молочной железы). Полученные результаты позволили не только описать сложную систему взаимодействий 7ГМР с транскриптомом, но и сформулировать новые механизмы онкопротекторного действия 7ГМР.

Результаты хемотранскриптомного анализа молекулы 7ГМР при оценке влияния на опухолевые клетки линии MCF7 указали на несколько важных особенностей ее транскриптомного воздействия. В частности, под воздействием 7ГМР может снижаться экспрессия онкопролиферативных генов (n = 401), генов синтеза белка (n = 194) и протеолиза белка (n = 70), синтеза АТФ в опухолевых клетках (n = 91) и регуляции хронического воспаления (n = 148). Уменьшение экспрессии этих групп генов тормозит процессы пролиферации и жизнедеятельности опухолевых клеток, одновременно защищая организм от избыточного воспаления. Параллельно 7ГМР способствовал преимущественному повышению транкрипции групп генов, вовлеченных в онкопротекторное действие (более 100 генов), в том числе генов, участвующих в поддержании онкопротекторного иммунитета, а также генов, опосредующих онкопротекторные свойства витамина D, ретиноидов и витамина С. Описанные изменения в транскрипции генов усиливают свойства воздействия лигнанов на белки протеома и указывают на перспективы использования 7ГМР у пациенток с опухолевыми заболеваниями.

Хемотранскриптомный анализ эффектов молекулы 7-гидроксиматаирезинола на опухолевые клетки молочной железы человека линии MCF7