Оценка эффективности радонотерапии и модуляции стероидогенеза в экспериментальной модели хронического эндометрита

Введение / Introduction

На сегодняшний день акцентуация роли прегравидарной (преконцепционной) подготовки входит в число ключевых задач акушерско-гинекологической службы. Доля супружеских пар, прошедших преконцепционную подготовку, в Российской Федерации составляет не более 4 % [1]. При этом даже в благоприятных для зачатия условиях фертилизация реализуется в беременность только в 30 % случаев, а невынашивание и бесплодие у пациенток репродуктивного возраста обеспечивают неутешительные демографические показатели [2].

Одними из ведущих причин инфертильности и репродуктивных потерь являются инфекционно-воспалительные и эндокринные факторы. Среди воспалительных заболеваний органов малого таза до 73 % случаев гистологически верифицируется хронический эндометрит (ХЭ), который выступает как этиологический фактор в случаях с привычными потерями беременности до 50 %, с нарушением репродуктивной функции – до 23 %, с неудачами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) – до 60 % [3–9]. В структуре эндокринных дисфункций недостаточность лютеиновой фазы, связанная с нарушениями секреции прогестерона желтым телом, рассматривается как значимый фактор бесплодия и ранних потерь беременности в естественном цикле и в рамках программ ВРТ. Известно, что в условиях дефицита прогестерона нарушаются адекватная имплантация, секреторная трансформация эндометрия и рост эмбриона [10–12]. На разработку эффективных и безопасных методов коррекции данных нарушений на сегодняшний день направлен вектор научного поиска акушерско-гинекологического сообщества [13–15].

Большой интерес в аспекте прегравидарной подготовки представляют природные физические факторы ввиду широкого арсенала клинических эффектов, доступности, безопасности и малоинвазивности данных методик. Широкое применение в практике нашла методика бальнеотерапии минерально-газовыми радоновыми водами благодаря иммуномодулирующему, противовоспалительному, дренажно-дезинтоксикационному действию, коррекции психоэмоциональных и вегетососудистых нарушений [16][17]. Указанные лечебные эффекты радоновой бальнеотерапии обусловлены наличием растворенного в минеральной воде радона (Rn) – инертного газа, распад которого сопровождается α-излучением. При бальнеопроцедуре через кожу в организм проникает не более 0,5 % радона и 1,5–2 % его дочерних продуктов, 60 % которых далее диффундируют в подлежащие ткани и кровеносное русло, что обусловливает высокую концентрацию продуктов ионизации в органах и тканях [18, 19]. Известна высокая результативность применения радонотерапии при гинекологических гормонозависимых заболеваниях, ассоциированных с гиперэстрогенией, благодаря модуляции гормонального гомеостаза [20], но научных работ по ее эффективности при хроническом воспалительном процессе эндометрия нами в доступной литературе не найдено.

Хронический эндометрит и нарушение стероидогенеза зачастую играют ключевую роль в этиопатогенезе невынашивания и репродуктивных потерь, что позволяет рассматривать терапевтические эффекты радонотерапии как перспективные для прегравидарной подготовки инфертильных пациенток. Ввиду недостатка актуальных литературных данных относительно указанного аспекта применения природных физических факторов нами было проведено экспериментальное исследование.

Цель: оценка терапевтической эффективности и модуляции стероидогенеза при применении радонотерапии в экспериментальной модели ХЭ.

Материалы и методы / Materials and Мethods

Дизайн исследования / Study design

В условиях экспериментальной модели ХЭ определяли противовоспалительное действие радонотерапии, проведенной по стандартным методикам; изучали влияние радонотерапии и комплексного лечения на содержание эстрадиола и прогестерона в крови лабораторных животных для оценки возможностей применения результатов исследования в клинической практике при прегравидарной подготовке пациенток с ХЭ.

В эксперименте изучали терапевтический эффект природного физического фактора – бальнеотерапии (радонотерапии). Использовалась слабоминерализованная (0,3 г/л) щелочная (рН = 9,2) сульфатно-гидрокарбонатно-натриевая минеральная вода с низким содержанием радона: радиоактивность 5,4–6,2 нКи/дм³ из источника – скважины № 4Э Белокурихинского месторождения (Алтайский край), температурой 38–40 °С. С учетом периода полураспада радона (3,8 сут) доставка минеральной воды из источника в виварий производилась каждые трое суток. В качестве сравнительной лечебной методики оценивали эффективность пелоидотерапии природной соленасыщенной среднесульфидной иловой лечебной грязи озера Мармышанское Романовского района Алтайского края температурой 38–40 °С.

Эксперимент проводили на самках лабораторных крыс линии Wistar (n = 40), возрастом 3 мес, массой тела 180–200 г. Животных содержали в стандартных условиях сертифицированного вивария ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России при температуре воздуха в помещении 20–22 °С со свободным доступом к пище и воде.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование было одобрено Комитетом по этике при ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России, протокол № 9 от 28.10.2021. Эксперимент проводили в соответствии с директивами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах или иных научных целых (Страсбург, 1986).

Моделирование хронического эндометрита / Chronic endometritis model

У всех крыс формировали экспериментальный ХЭ по следующей запатентованной методике: в маточный рог лабораторной крысы методом спринцевания вводили аутокаловую взвесь в объеме 0,1 мл [21]. Сбор аутокала лабораторных крыс производили перед началом эксперимента. Животные за сутки до сбора материала были ограничены в пище, но при этом имели свободный доступ к воде. После смешивания аутокала с физиологическим раствором в соотношении 1:10 полученный раствор дважды фильтровали через марлевый стерильный материал. Далее в полость маточного рога всех крыс методом спринцевания через маточный зонд вводили полученную смесь. На основании экспериментальных данных, ХЭ начинает формироваться не ранее чем через 40 дней после введения аутокаловой взвеси.

Группы животных / Аnimal groups

Животные были разделены на 4 группы: контрольная группа (n = 10), опытная группа (n = 10), группа сравнения I (n = 10), группа сравнения II (n = 10). С третьих суток после манипуляции моделирования ХЭ животные опытной группы и групп сравнения I, II начинали получать антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия (цефтриаксон) в соответствии с весом животного в течение 7 дней из расчета 20 мг на 1 кг массы в сутки – 0,4 мл внутримышечно при весе животного 200 г.

C 41-го дня после введения аутокаловой взвеси животные получали лечение с применением природных факторов по следующей схеме: крысы опытной группы получали радоновые ванны 1 раз в день, № 10; первая процедура длительностью 5 мин, вторая – 8 мин, третья – 10 мин, далее все процедуры по 15 мин. Крысы группы сравнения I получали ванны с минеральной водой и пелоидотерапию; в один день животные сначала получали радонотерапию по 1 процедуре в день (первая процедура длительностью 5 мин, вторая – 8 мин, третья – 10 мин, далее все процедуры по 15 мин), после чего проводили пелоидотерапию (через 2 ч после бальнеотерапии 1 раз в день в течение 10 мин); всего 10 процедур бальнеотерапии и пелоидотерапии на курс с проведением обеих процедур ежедневно. Крысы группы сравнения II получали только пелоидотерапию по схеме, аналогичной для группы сравнения I. Крысы контрольной группы после моделирования экспериментального ХЭ лечения не получали.

Методы исследования / Study methods

После окончания эксперимента проводили отбор крови из латеральной хвостовой вены у всех животных для исследования уровней эстрадиола и прогестерона, после чего под эфирным наркозом проводилась лапаротомия с гистерэктомией и краниоцервикальная декапитация.

Вырезку образцов гистологического материала производили на уровне тела матки (в области бифуркации) и в средней части правого и левого рога матки. Для подготовки к морфологическому исследованию полученные образцы в течение 24–48 ч фиксировали в 10 % нейтральном формалине, далее материал обрабатывали в автомате гистологической проводки Tissue-Tek VIP TM6 (Sakura, Япония), после – на станции парафиновой заливки Tissue-Tek TEC 5 (Sakura, Япония) с использованием парафина Histomix (BiOvitrum, Россия). Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм получали на роторном микротоме Accu-Cut SRM (Sakura, Япония). Далее применяли окраску по стандартной методике с гематоксилином и эозином в автостейнере Tissue-Tek Prisma (Sakura, Япония), затем препараты заключали под пленку в автомате Tissue-Tek Film (Sakura, Япония). Фотофиксацию гистологической картины эндометрия производили при помощи микроскопа Leica DM 750 (Leica Microsystems, Германия) с цифровой видеокамерой Leica EC3 (Leica Microsystems, Германия). Подсчет клеточной плотности воспалительного инфильтрата производили при увеличении микроскопа ×400 в 5 полях зрения, в каждом случае в программе Image Tool 3.0. с помощью инструмента Count and Tag.

Гистологическое исследование микропрепаратов эндометрия животных группы сравнения II, получавших пелоидотерапию в сочетании с антибактериальной терапией, не проводилось ввиду известного и описанного раннее в литературе противовоспалительного эффекта пелоидов в отношении гистологических маркеров ХЭ [22–24].

Во всех экспериментальных группах исследовали уровни гормонов (прогестерон, эстрадиол) в венозной крови путем иммуноферментного анализа (ИФА) с применением 96-ти луночных планшетов Стероид ИФА-17-ОН-прогестерон 100-31 и 100-40 Стероид ИФА-эстрадиол (Алкор Био, Россия).

Статистические методы / Statistical analysis

Для статистической обработки результатов исследования применяли пакет статистических программ SPSS Statistics версия 23 (IBM, США) и возможности статистического анализа в программе Microsoft Excel 2010. Производили расчет среднего арифметического (M) и ошибки среднего арифметического (m) при нормальном распределении данных в выборке или медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q₁–Q₃) при ненормальном распределении данных. Для оценки нормальности распределения данных использовали критерий Шапиро–Уилка. Методы параметрической статистики применяли при нормальном распределении данных (t-критерий Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения, то применяли критерий Манна–Уитни. Пороговым значением значимости данных считали р < 0,05.

Результаты / Results

При гистологическом исследовании в эндометрии крыс контрольной группы выявлена диффузная воспалительная инфильтрация, представленная лимфоцитами, макрофагами, эозинофилами и нейтрофилами, затрагивающая поверхностный и базальный слои эндометрия. Плотность воспалительного инфильтрата составила 180,7 ± 9,0 клеток. Эпителий желез находился в состоянии атрофии. В строме эндометрия определялись выраженные явления отека, синусоидные капилляры, сосуды находились в состоянии выраженного полнокровия с набухшим эндотелием (рис. 1).

При исследовании образцов гистологического материала опытной группы (радонотерапия в комбинации с антибактериальной терапией) отмечалось снижение плотности воспалительного инфильтрата (на 30,7 % по отношению к контрольной группе; р = 0,002) до 125,4 ± 8,1 клеток. В инфильтрате преобладали эозинофилы, лимфоциты определялись в небольшом количестве (рис. 2). Воспалительная инфильтрация отмечалась в поверхностных и глубоких базальных отделах эндометрия, имелись слабые признаки отека стромы. Сосуды находились в состоянии менее выраженного полнокровия. Выраженных атрофических изменений желез стромы не отмечалось.

Гистологическая картина эндометрия животных группы сравнения I, получавших комбинированное лечение в виде антибактериальной, радоно- и пелоидотерапии, была максимально приближена к интактным здоровым животным: воспалительная инфильтрация была представлена небольшим количеством лимфоцитов, единичными нейтрофилами, локализующимися лишь в поверхностных слоях эндометрия. Плотность воспалительной инфильтрации оказалась минимальной и составила 20,5 ± 1,8 клеток (снижена на 88,7% в сравнении с контрольной группой; р = 0,000001). Признаки отека стромы не определялись (рис. 3).

Результаты содержания стероидных гормонов в крови лабораторных животных представлены в таблице 1.

Выявлено, что под влиянием радонотерапии в основной группе, радонотерапии и пелоидотерапии в группе сравнения I и пелоидотерапии в группе сравнения II происходило статистически значимое повышение уровня прогестерона в крови после лечения в сравнении с контрольной группой (р = 0,008). При применении радонотерапии в опытной группе отмечалось более выраженное повышение уровня прогестерона в сравнении с применением пелоидотерапии в группе сравнения II. Под влиянием радоновой бальнеотерапии у лабораторных животных основной группы происходило значимое снижение уровня эстрадиола в сравнении с контрольной группой (р = 0,008) в отличие от групп сравнения I и II, где существенного изменения уровня эстрадиола по сравнению с группой контроля не наблюдалось.

Обсуждение / Discussion

В условиях экспериментальной модели эндометрита продемонстрирована терапевтическая эффективность радонотерапии в отношении снижения выраженности гистологических признаков воспаления: снижение плотности воспалительной инфильтрации, представленной макрофагами, эозинофилами и нейтрофильными лейкоцитами, выраженности признаков отека стромы, полнокровия сосудов стромы. Плотность воспалительного инфильтрата в результате лечебного воздействия радонотерапии в сочетании с антибактериальной терапией уменьшилась на 30,7 % (р = 0,002), а в комплексе с пелоидотерапией – на 88,7 % (р = 0,000001). При сочетании лечебных методик грязелечения, радонотерапии и антибактериальной терапии в эксперименте отмечен потенцированный противовоспалительный эффект.

Согласно действующим протоколам лечения пациенток с гистологически верифицированным ХЭ, первым этапом проводится этиотропная антибактериальная терапия, вторым – восстановление морфофункционального потенциала, устранение вторичных повреждений и обеспечение регенерации эндометриальной ткани [25]. В программу комплексного лечения ХЭ рекомендовано включать мероприятия, направленные на восстановление секреторной трансформации эндометрия. Потому хроническое латентное воспаление, как правило, сопровождает эндометриальная дисфункция (эндометриопатия), при которой наблюдается нарушение рецептивности ткани эндометрия, секреции интегринов и микроглобулинов, а также задержка формирования пиноподий и «окна имплантации» [25].

Наиболее показательный результат в проведенном нами моделировании экспериментального эндометрита был продемонстрирован в группе лабораторных животных, которые получали комплексное лечение. Гистологическая картина эндометрия максимально была приближена к группе интактных животных, что позволяет констатировать – комплексная терапия природными физическими факторами в сочетании с этиотропной антибактериальной терапией приводит к полноценному восстановлению морфологической структуры эндометрия. Оценка стероидогенеза в эксперименте продемонстрировала модулирующее действие радонотерапии: выраженное повышение уровня прогестерона при одновременном достоверном снижении эстрадиола венозной крови животных. С клинической точки зрения указанное терапевтическое действие радона приведет к коррекции эндометриопатии и недостаточности секреторной трансформации эндометрия.

Схожие экспериментальные исследования по изучению терапевтической эффективности различных лечебных факторов в отношении гистологических маркеров ХЭ проводились отечественными учеными. Так, в эксперименте на половозрелых самках крыс определяли влияние магнийсодержащей композиции (МСК) – природного полиминерала (Бишофит) на морфологические показатели клеточной инфильтрации в условиях ХЭ, а также на показатели активности желатиназы В в ткани эндометрия [26]. Было выявлено, что под влиянием магнийсодержащего препарата у крыс с экспериментальным ХЭ увеличивалась активность желатиназы В в строме. При этом наблюдалось увеличение содержания магния в эритроцитарной массе крови из нижней полой вены, что сопровождалось восстановлением эозинофильно-плазмоцитарной и увеличением макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации тканей эндометрия по сравнению с этими показателями у животных с экспериментальным ХЭ без терапии. В сравнении с полученными нами результатами оценки эффектов радонотерапии, магнийсодержащий комплекс не привел к выраженному противовоспалительному эффекту в отношении гистологических маркеров ХЭ, продемонстрировав модуляцию клеточного состава воспалительного инфильтрата. При этом повышение активности матриксных металлопротеиназ под влиянием МСК, полученное в эксперименте, обеспечивало один из вариантов патогенетической терапии и препятствовало хронизации воспалительного процесса в эндометрии, что не было изучено в отношении радонотерапии.

Высокие результаты противовоспалительной эффективности на биологической модели экспериментального эндометрита продемонстрировало исследование с ортилией однобокой (Orthilia secunda (L.) House) [15]. Показано, что экстракт ортилии однобокой в дозе 0,04 мг/кг в сутки приводит не только к нормализации морфологии эндометрия, но и к секреторной его перестройке, необходимой для имплантации плодного яйца. Результаты модуляции стероидогенеза, полученные при применении радонотерапии в эксперименте, могут обеспечивать благоприятный гормональный фон и соответствующие ему морфологические изменения в эндометрии для адекватного формирования «окна имплантации». Однако полученные результаты экспериментального исследования требуют проведения дальнейших клинических испытаний для подтверждения указанных терапевтических эффектов. При проведении исследований следует учитывать ограничения к применению радонотерапии, связанные с наличием ряда противопоказаний для данной методики, такие как лейкопения, гипертиреоз, плохая переносимость радоновой минеральной воды (повышенная потливость, одышка, головокружение и проч.), доброкачественные опухоли, вегетососудистые дисфункции.

Заключение / Conclusion

В условиях экспериментальной модели ХЭ продемонстрирована противовоспалительная эффективность радоновой бальнеотерапии. При комплексном применении радонотерапии и пелоидотерапии отмечается потенцирующий эффект. Под воздействием радоновой бальнеотерапии происходит модуляция стероидогенеза, которая заключается в значимом повышении уровня прогестерона при достоверном снижении уровня эстрадиола. Это позволяет рассматривать данную методику как перспективную для проведения клинических исследований, которые позволили бы подтвердить ее эффективность у пациенток с репродуктивной дисфункцией, включая заболевания, сопровождающиеся гиперэстрогенией.