Исследование плацентарного транскриптома у пациенток с осложненным течением беременности

Введение / Introduction

Несмотря на значительные достижения современной медицинской науки, патологии, объединенные в группу «больших акушерских синдромов» (БАС), продолжают сохранять свою медико-социальную значимость, обуславливая высокий процент репродуктивных потерь [1][2].

Несмотря на достаточную вариабельность первопричин БАС, объединению данных патологических состояний в одну группу способствовало расширение представлений о плаценте как важнейшем провизорном органе, который обеспечивает физиологическое течение беременности и нормальное развитие плода [3]. Формирование плаценты подразумевает сложный процесс, который требует координированной регуляции процессов дифференцировки, миграции и инвазии трофобласта. Развитие дисфункции плаценты, составляющей патофизиологическую основу БАС, сопровождается каскадом патологических процессов на различных уровнях организации, включая генетические аберрации и эпигенетические воздействия [4][5].

В современном научном мире в качестве ключевого механизма влияния на транскрипционную активность генов рассматривается изменение количества и функциональной активности молекул микроРНК, представляющих собой короткие некодирующие последовательности длиной 18–25 нуклеотидов. Достижения последних десятилетий в области молекулярной биологии позволили описать более 500 микроРНК, ассоциированных с процессами созревания и функционирования плаценты [6]. Данные литературы свидетельствуют о вовлеченности молекул микроРНК в развитие гестационного сахарного диабета [7], преэклампсии (ПЭ) [8–15], преждевременных родов [16], задержки роста плода (ЗРП) [17]. Доказано, что будучи мультигенными регуляторами, микроРНК участвуют практически во всех фундаментальных процессах плацентации, включая миграцию, инвазию, клеточную пролиферацию, апоптоз, ангиогенез и развитие иммунологической толерантности [18–20].

Учитывая накопленные знания о роли микроРНК в развитии различных патологических состояний, становится возможным предположить перспективность дальнейшего изучения особенностей плацентарного траснкриптома при фетоплацентарной дисфункции. Кроме того, с клинической точки зрения, микроРНК, характеризующиеся аберрантной экспрессией в тканях плаценты, могут стать перспективными биомаркерами для оценки риска развития осложнений беременности и минимизации репродуктивных потерь.

Цель: изучение особенностей плацентарного транскриптома у пациенток с осложненным течением и исходом беременности.

Материалы и методы / Materials and Methods

Дизайн исследования / Study design

В 2022–2023 гг. выполнено проспективное наблюдательное сравнительное исследование в параллельных группах. Обследовано 44 женщины, родоразрешенных на базе Перинатального центра ГБУЗ РК РКБ им. Н.А. Семашко (Симферополь). Среди участниц исследования были выделены 3 группы: группу 1 составили 13 беременных с ПЭ умеренной и тяжелой степени, манифестирующей до и после 34 нед гестации; в группу 2 вошли 12 пациенток, у которых беременность осложнилась ЗРП; контрольная группа включала 19 женщин с физиологическим течением беременности и неосложненными родами.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в группу с ПЭ: возрастная группа от 18 до 45 лет; одноплодная беременность в сроках гестации от 22 до 42 нед; установленный согласно Федеральным клиническим рекомендациях Российского общества акушеров-гинекологов (РОАГ) диагноз ПЭ [21].

Критерии включения в группу с ЗРП: возрастная группа от 18 до 45 лет; одноплодная беременность в сроках гестации от 22 до 42 нед; установленный согласно Федеральным клиническим рекомендациях РОАГ диагноз ЗРП [22].

Критерии включения в контрольную группу: возрастная группа от 18 до 45 лет; одноплодная беременность в сроках гестации от 22 до 42 нед; неосложненное течение беременности, родов и послеродового периода.

Критерии исключения: возраст младше 18 лет; декомпенсированные формы экстрагенитальной патологии в анамнезе; пациентки, перенесшие острые инфекционные заболевания во время беременности; пациентки с преждевременными родами, многоплодной беременностью; отказ от участия в исследовании.

Методы исследования / Study methods

Всем женщинам, участвовавшим в исследовании, проведено комплексное обследование, включавшее сбор анамнестических данных, объективный осмотр, проведение лабораторных и инструментальных исследований.

Общепринятое лабораторное обследование выполнено в объеме: общеклинический анализ крови; биохимический анализ крови; коагулограмма; госпитальный комплекс; общий анализ мочи; мазок из влагалища на флору.

Инструментальное обследование включало в себя ультразвуковую фетометрию, доплерометрическое исследование плодово-плацентарного и маточно-плацентарного кровотока (аппарат General Electric Voluson e6, GE Healthcare, США) и проведение кардиотокографии с использованием аппарата Сономед 200 (ООО «Спектромед», Россия).

При оценке состояния новорожденных рассчитывали балл по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, определяли антропометрические показатели, наличие осложнений.

Для реализации поставленных в ходе работы задач использованы специальные методы исследования, подразумевающие отбор образцов ткани плаценты с последующим определением профиля экспрессии 12 плаценто-специфичных микроРНК: miR-20a-5p, miR-143-3p, miR-146a-5p, miR-181a-5p, miR-210-3p, miR-320а-3p, miR-375-3p, miR-517a-3p, miR-517c-3p, miR-574-3p, miR-574-5p, miR-1304-5p [8–15]. Молекулярно-генетические методы исследования выполнялись на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Института «Медицинская академия имени С.И. Георгиевского» (Симферополь).

Выделение РНК из плацентарной ткани / Placental tissue RNA isolation

Отбор биоматериала проводили путем среза ткани плаценты от хориальной до базальной пластинки. Образец представлял собой лентообразный фрагмент плацентарной ткани шириной 5 мм. Забранный биоматериал промывали в 0,9% физиологическом растворе. Хранили образцы в жидком азоте при температуре –20 °С.

Выделение тотальной РНК из образцов плацентарной ткани осуществляли при помощи тест-системы miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Нидерланды) согласно инструкции производителя. Концентрацию выделенной РНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, Австрия). Качество образцов РНК оценивали в биоанализаторе Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США).

Обратная транскрипция и количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени / Reverse transcription and quantitative real-time polymerase chain reaction

Обратную транскрипцию проводили совместно с реакцией полиаденилирования. Для приготовления реакционной смеси использовали 2 набора: E. coli Poly (A) Polymerase kit (NEB, США) и MMLV RT kit (Евроген, Россия). К 4 мкл полученной смеси добавляли 750 нг РНК (в случае лизатов до и после преципитации) либо 16 мкл РНК (в случае преципитатов). В случае лизатов добавляли воду до конечного объёма 20 мкл. Программа обратной транскрипции: 60 мин при 37°С, 10 мин при 70 °С (для инактивации ферментов). Полученные образцы комплиментарной ДНК (кДНК) хранили при температуре –20 °С.

ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе ДТ-Прайм (ДНК-диагностика, Россия) с использованием готовой смеси qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия). Суммарный объём реакции составил 25 мкл. Реакцию ставили в трех технических повторах для каждого образца. Сравнительный анализ в отношении уровня экспрессии микроРНК в образцах проводили методом 2-ΔΔCT.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Института «Медицинская академия им. С.И. Георгиевского» (структурное подразделение ФГАОУ ВО КФУ им. В.И. Вернадского), протокол № 4 от 20.04.2022.

Исследование было проведено в соответствии с этическими стандартами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и ее последующими изменениями. Все обследованные женщины подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и проведение медицинских вмешательств.

Методы статистического анализа / Statistical analysis

Статистический анализ данных выполнен с помощью лицензионного пакета программ Statistica версия 6.0 (StatSoft Inc., США). Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка. При нормальном распределении данные представляли в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М ± σ) или медианы и 25-го и 75-го процентилей (Me [Q₁; Q₃]) при распределении, отличавшемся от нормального.

При сравнении категориальных показателей между группами применяли двусторонний критерий Фишера. Анализ степени экспрессируемости исследуемых микроРНК в группах сравнения выполнен с использованием теста Вилкоксона–Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение / Results and Discussion

Клиническая характеристика участниц исследования / Clinical characteristics of study participants

Все включенные в исследование женщины были сопоставимы по возрасту, антропометрическим и анамнестическим данным (табл. 1).

Сравнительный анализ уровней артериального давления (АД) выявил статистически значимые различия между группами обследованных. Так, женщины из группы ПЭ имели наибольшие значения систолического (САД) и диастолического (ДАД) давления по сравнению с группой ЗРП (p < 0,05 и p < 0,05, соответственно) и контрольной группой (p < 0,01 и p < 0,001, соответственно). Данные отличия укладываются в общепринятые представления о ПЭ и являются патогномоничными для данного осложнения беременности.

Установленные достоверные различия в отношении некоторых показателей общеклинического и биохимического анализов крови между группами обследованных не являются клинически значимыми и не могут быть предметом множественного сравнения.

Оценка перинатальных исходов и неонатальной заболеваемости представлена в таблице 2.

Все беременные, включенные в исследование, были родоразрешены в среднем в 39,19 [ 37,11; 40,5] нед беременности; 11 (25 %) беременных из числа обследованных женщин были родоразрешены путем операции кесарева сечения. Обращают на себя внимания достоверные отличия между группами по массе тела новорожденных. Так, в группе ПЭ данный показатель в среднем составил 3230 г, в группе ЗРП – 2355 г, в группе контроля – 3720 г. Все участницы исследования имели сопоставимые показатели в отношении клинического статуса новорожденных по шкале Апгар. Группы сравнения были сопоставимы по показателю неонатальной заболеваемости, при этом имеющаяся тенденция к увеличению процента патологии новорожденных детей в группе женщин с ПЭ не дос- тигала статистической значимости.

Профиль экспрессии плацентарных микроРНК участниц исследования / Placental miRNAs expression profile in study participants

Результаты исследования плацентарного транскриптома позволили выявить ряд особенностей у пациенток с осложненным и неосложненным течением беременности (рис. 1, 2).

Выполненный ПЦР-анализ указал на отсутствие экспрессии анализируемых miR-210-3p, miR-320-3p, miR-1304-5p и miR-375-5p в образцах ткани плаценты пациенток с ЗРП (рис. 1: a, b, c, d). Статистически значимых различий в содержании плацентарных микроРНК у пациенток с ЗРП по сравнению с пациентками с ПЭ и здоровыми женщинами не выявлено, что согласуется с результатами работы R. Inno с соавт., которые проанализировали специфическую плацентарную сигнатуру микроРНК (miRNome) при некоторых поздних осложнениях беременности (ПЭ, гес- тационный диабет, ЗРП, макросомия плода) и указали на изменения транскриптома именно при ПЭ [23].

Проведенное профилирование в нашем исследовании позволило идентифицировать все 12 изучаемых молекул микроРНК в плацентарной ткани женщин с ПЭ. Стоит отметить, что данные изменения в группе женщин с ПЭ носили разнонаправленный характер, при этом значимые изменения определены лишь в отношении 4 микроРНК. Так, содержание miR-517a-3p (p = 0,025), miR-517с-3p (p = 0,036), miR-574-5p (p = 0,015) было статистически значимо ниже по сравнению с группой женщин с физиологически протекающей беременностью (рис. 2: f, g, h), в то время как концентрация miR-517a-3p, напротив, была повышена (p = 0,046).

В своей работе L. Anton с соавт. указывают на вовлеченность miR-517a-3p и miR-517c-3p в развитие ПЭ посредством индукции изменений развития ворсинчатого древа и сосудистой системы ворсин в I триместре беременности. Показано, что повышенная экспрессия молекул семейства miR-517 приводит к снижению инвазии трофобласта, увеличению экспрессии гена TNF-сигнального пути (TNFSF15) и высвобождению антиангиогенного белка растворимой fms-подобной тирозинкиназы 1 (англ. soluble fms-like tyrosine kinase 1, sFLT1) [8]. При этом низкие уровни экспрессии рассматриваемых молекул, напротив, ассоциированы с процессами клеточной пролиферации и ангиогенеза. Обнаруженное нами статически значимое снижение miR-517a-3p и miR-517c-3p в плаценте у пациенток с ПЭ, по-видимому, связано с плацентарной дисфункцией, характерной для данной патологии беременности, и происходит в рамках компенсаторных реакций.

В аспекте акушерско-гинекологической патологии miR-574 традиционно рассматривается в качестве ключевого модулятора эндотелиальной дисфункции. Так, в работе S. Lip с соавт. показан ингибирующий потенциал miR-574-5p в отношении процессов миграции и пролиферации эндотелиоцитов, а также репарации поврежденной поверхности [11]. В нашем исследовании продемонстрировано снижение экпрессированности miR-574-3p и miR-574-5p в образцах ткани плаценты пациенток с ПЭ, что может объясняться фенотипической гетерогенностью данной патологии. Обнаруженные изменения указывают на отсутствие развития выраженного повреждения эндотелия и эндотелиальной дисфункции у пациенток с умеренной поздней ПЭ, которые в рамках данной работы составили бóльшую часть группы исследования.

Интерес представляют также результаты нашего исследования, полученные в отношении miR-20a-5p. Повышенные уровни экспрессированности плацентарной miR-20a-5p у женщин с ПЭ согласуются с результатами ранее опубликованных исследований [24–26]. Известно, что miR-20a-5p принимает участие в процессах миграции, дифференцировки и пролиферации трофобласта, ангиогенеза. W. Wang с соавт. сообщают, что активация miR-20a способна нарушать ремоделирование спиральных сосудов во время плацентации за счет подавления сигналинга в системе EphrinB2/EphB4 [24]. Согласно данным литературы, дисрегуляция данной микроРНК также имеет место при кардио- васкулярных нарушениях и инфаркте миокарда [27].

Результаты проведенной работы позволили установить, что развитие ПЭ сопровождается явной дисрегуляцией микроРНК, ассоциированных с процессами изменения морфофункциональных свойств трофо- бласта, воспалительными реакциями, сердечно-сосудистыми и метаболическими заболеваниями. Учитывая гетерогенность форм ПЭ у женщин, включенных в исследование, можно предположить общность ряда молекулярных механизмов в развитии различных клинических фенотипов данной патологии.

Известно, что большинство ученых относят ПЭ и ЗРП к истинно «плацентарным осложнениям». Данные суждения косвенно подтверждаются результатами текущего исследования. Несмотря на отсутствие статистической значимости в профиле экспрессии плацентарных микроРНК в группе ЗРП, показан однонаправленный характер изменений экспрессии микроРНК в обеих группах женщин с осложненным течением и исходом беременности.

Заключение / Conclusion

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что осложнения беременности характеризуются специфическими молекулярными изменениями на уровне плацентарного транскриптома. Установленные в работе аберрантные значения уровней экспрессии miR-517a-3p, miR-517с-3p, miR-574-5p, miR-20a-5p в плазме крови пациенток с ПЭ указывают на вовлеченность микроРНК в разитие заболевания и подтверждают данные о ключевом значении плацентарной дисфункции в патогенезе данной патологии.

Полученные результаты относительно динамики содержания микроРНК требуют дальнейшей верификации на большей выборке пациентов с применением альтернативных биотехнологичных методов для уточнения влияния идентифицированных молекул на регуляторные сигнальные пути.