Дисрегуляция функции тромбоцитов у больных COVID-19

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

COVID-19 – потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, вызываемая коронавирусом SARS-CoV-2 и приводящая к острой лёгочной недостаточности, повреждению эндотелия, иммунотромбозу, нарушению баланса между коагуляцией и воспалением и к активации тромбоцитов [1]. Часто у пациентов с COVID-19 обнаруживаются тромбозы глубоких вен (ТГВ) и тромбоэмболия легочных артерий (ТЭЛА) [2][3]. У пациентов с COVID-19 в отделении интенсивной терапии частота венозных тромбоэмболических осложнений (ВТЭО) составляет 36–46 % по разным источникам [4][5]. Подобно венозному тромбозу, у 1–5 % пациентов с COVID-19 встречаются артериальные тромбозы (ишемический инсульт, острый коронарный синдром, ишемия конечностей и брыжейки) [6]. Как правило, тяжелое течение инфекции SARS-CoV-2 наблюдается при сильной воспалительной реакции из-за высвобождения и инфильтрации нейтрофилов в различных органах с образованием внеклеточных ловушек нейтрофилов (англ. neutrophil extracellular traps, NETs), активацией тромбоцитов и цитокиновым штормом [7].

Тромбоциты представляют собой небольшие безъядерные плоские бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, и традиционно известны своей ролью в предотвращении кровотечений и минимизации сосудистых повреждений [8]. Однако на сегодняшний день известна негемостатическая роль тромбоцитов как активных участников воспалительных и иммунных реакций на микробные организмы при инфекционных заболеваниях. Это связано с их способностью высвобождать множество воспалительных и биологически активных молекул, хранящихся в их гранулах [9]. Эти медиаторы способны привлекать и модулировать активность циркулирующих лейкоцитов, что важно для организации локализованных иммунных реакций на патогенные микроорганизмы [10]. Кроме того, тромбоциты обладают прямыми эффекторными функциями и способны взаимодействовать с вирусными рецепторами [11]. Действительно, было доказано, что мегакариоциты и тромбоциты экспрессируют несколько иммуно-ассоциированных молекул и рецепторов, включая Fc-рецепторы [12], рецепторы комплемента [13], рецепторы хемокинов [14] и множество толл-подобных рецепторов (англ. toll-like receptors, TLR) [15].

Иммунные функции тромбоцитов в ответ на вирусные инфекции стали ключевыми участниками защиты хозяина, которые при дисрегуляции могут способствовать заболеванию [16]. Гиперактивация тромбоцитов была признана отличительной чертой многих вирусных инфекций, включая лихорадку денге [17], вирусы иммунодефицита человека [18] и гриппа [19], в том числе вирус SARS-CoV-2 [20]. Характерной особенностью SARS-CoV-2 в отличие от других вирусных инфекций является коагулопатия с аномальными изменениями в системе гемостаза. Склонность вируса поддерживать тромботические события может быть связана с его способностью изменять физиологию эндотелия, иммунных клеток и тромбоцитов.

Вирус SARS-CoV-2 может индуцировать как местную, так и системную активацию тромбоцитов, включая высвобождение воспалительных цитокинов, которые играют роль как в распространении COVID-19, так и в генерации цитокинового шторма.

COVID-19 И ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ / COVID-19 AND THROMBOCYTOPENIA

Многие вирусные и бактериальные инфекции, как правило, ассоциируются с тромбоцитопенией [21]. Независимые исследования со всего мира привели многочисленные сообщения о том, что COVID-19 также следует этой тенденции. Умеренная тромбоцитопения является общей чертой инфекции SARS-CoV-2, в то время как значительно сниженное количество тромбоцитов встречается редко и, вероятно, представляет собой развивающуюся коагулопатию [22]. Тромбоцитопения при COVID-19 является показателем плохого прогноза, особенно когда количество тромбоцитов уменьшается в первые 7 дней после госпитализации, что говорит о том, что тромбоцитопения является независимым фактором риска, связанным со смертностью при COVID-19.

Существуют различные механизмы, лежащие в основе тромбоцитопении, ассоциированной с COVID-19 (рис. 1).

Считается, что SARS-CoV-2 напрямую заражает костный мозг через определенные рецепторы и ингибирует кроветворение, снижая образование первичных тромбоцитов, что приводит к тромбоцитопении [24]. Сходство нуклеотидов между SARS-CoV-2 и тяжёлым острым респираторным синдромом (SARS?CoV) составляет 82 %, а поскольку SARS-CoV и коронавирус человека 229E (HCoV-229E) проявляют эквивалентные антигенные свойства, многие авторы предполагают, что антигены SARS-CoV-2 и HCoV?229E родственны. HCoV-229E достигает клеток костного мозга и тромбоцитов через рецептор аланинаминопептидазы (аминопептидаза-N; CD13) [25][26]. CD13 – мембранный белок, относящийся к классу металлопротеаз, является маркером гранулоцитов и моноцитов, обнаруживаемый в эпителиальных клетках дыхательных путей, гладкомышечных клетках, фибробластах, почках и эпителиальных клетках тонкой кишки, лимфоцитах и тромбоцитах [27]. Таким образом, полагаясь на данный механизм, можно предположить, что SARS-CoV-2 вызывает тромбоцитопению также, как SARS-CoV и HCoV-229E [24].

J. Ropa с коллегами исследовали экспрессию ангиотензинпревращающего фермента 2 (англ. angiotensin-converting enzyme 2, ACE2), с которым связывается спайковый белок SARS-CoV-2, в гемопоэтических стволовых клетках (англ. hematopoietic stem cells, HSCs), полученных из пуповинной крови, и показали, что ACE2 экспрессируется в 65 % HSCs [28]. Таким образом, возможно, что SARS-CoV-2 может непосредственно поражать HSCs, снижая первичную продукцию тромбоцитов.

Другим механизмом снижения продукции тромбоцитов является вторичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis, sHLH), также известный как синдром массивной активации макрофагов (англ. macrophage activation syndrome, MAS) [29]. MAS вызывается чрезмерным расширением и активацией мононуклеарных макрофагов, что приводит к выработке большого количества воспалительных цитокинов и потреблению значительного количества клеток крови. При SARSCoV2 Т-лимфоциты сверхактивируются и продуцируют гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (англ. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) и интерлейкин-6 (англ. interleukin-6, IL-6) [30][31]. GM-CSF стимулирует CD14+CD16+, воспалительные мононуклеарные макрофаги для выработки большего количества IL-6 и других факторов воспаления, что приводит к цитокиновому шторму и иммунологическому повреждению легких и полиорганной недостаточности. Цитокиновый шторм ведет к разрушению гемопоэтических клеток-предшественников в костном мозге со снижением первичной выработки тромбоцитов, что приводит к тромбоцитопении в периферической крови [32][33].

Еще одним важным механизмом уменьшения числа циркулирующих тромбоцитов является их повышенное потребление. Как уже известно, легкие пациентов с коронавирусной инфекцией характеризуются диффузным повреждением альвеол, застойными явлениями, задержкой жидкости, фиброзом и расширением гиалиновой мембраны [34]. Повреждение легочной ткани и микрососудистого эндотелия может приводить к активации тромбоцитов, агрегации, образованию микрососудистых тромбов и секвестрации тромбоцитов легкими [33].

Существуют также альтернативные механизмы, которые включают антитромбоцитарные аутоантитела и иммунные комплексы, приводящие к тромбоцитопении. Иммунные комплексы часто состоят из иммуноглобулинов (англ. immunoglobulin, Ig) типа IgG или IgM, но также могут быть IgA. Антитела и иммунные комплексы, осажденные на поверхности тромбоцитов, распознаются ретикулоэндотелиальными клетками и разрушаются как ткани-мишени, что приводит и к разрушению тромбоцитов [35][36], Кроме того, более трети иммуногенных белков при SARS-CoV-2 содержат гомологичные белки, являющиеся частью иммунной адаптивной системы человека. В этих случаях развитие иммунной тромбоцитопении связано с презентацией антигена главного комплекса гистосовместимости (англ. major histocompatibility complex, MHC) класса I и II, а также сигнализацией программированной гибели клеток-1 PCD1 (англ. рrogrammed cell death-1; CD279) из-за аномального иммунного ответа на гомологичные белки [37][38].

Тромбоциты содержат только один рецептор FcγRIIa (CD32) на своей поверхности и, таким образом, способны связывать IgG-специфические иммунные комплексы [39]. Наиболее характерным расстройством в этом случае является гепарин-индуцированная тромбоцитопения (ГИТ) [40]. ГИТ – протромботическое осложнение, которое возникает после лечения гепарином. Согласно клиническим рекомендациям, антитромботическая терапия пациентов с COVID-19 включает использование гепарина. Такая неблагоприятная лекарственная реакция вызывается IgG-специфическими антителами, нацеленными на тромбоцитарный фактор 4 (англ. platelet factor 4, PF4) с образованием иммунных комплексов и активацией тромбоцитов через рецептор СD32 [41]. Иммунные комплексы также участвуют в активации моноцитов и клеток эндотелия, что приводит к экспрессии тканевого фактора (англ. tissue factor, TF), активации внешнего пути свертывания и продукции воспалительных цитокинов [42]. Активация тромбоцитов и повреждение эндотелиальных клеток увеличивают синтез тромбина, что и приводит к возникновению клинической картины. Появление в плазме IgG происходит в среднем на 4–10-е сутки, что совпадает с началом клинических проявлений, таких как ТГВ нижних конечностей, ТЭЛА, тромбоз церебрального синуса, а также артериальные тромбозы с нарушением мозгового кровообращения и инфарктом миокарда [43]. Риск ГИТ в 10 раз ниже при использовании низкомолекулярного гепарина (НМГ) по сравнению с нефракционированным гепарином (НФГ); таким образом, для тромбопрофилактики при COVID-19 предпочтительнее НМГ [44].

Было бы упущением не затронуть вакцин-индуцированную тромботическую тромбоцитопению (англ. vaccine induced immune thrombotic thrombocytopenia, VITT) в контексте активации тромбоцитов и COVID-19. VITT – это расстройство, связанное с вакцинацией аденовирусными векторнымми вакцинами ChAd-Ox1 (AstraZeneca) и Ad26.COV2.S (Johnson & Johnson). VITT была впервые описана у 11 пациентов, у которых появились тромбозы необычной локализации (в церебральных синусах и абдоминальных венах) и тромбоцитопения [45]. VITT, как и ГИТ, является анти-PF4-опосредованным антителами расстройством, которое вызывает активацию тромбоцитов и тромбоз.

Таким образом, тромбоцитопения при COVID-19 является показателем плохого прогноза, особенно когда количество тромбоцитов уменьшается в первые 7 дней после госпитализации, что говорит о том, что тромбоцитопения является независимым фактором риска, связанным со смертностью при COVID-19 (рис. 2).

ГИПЕРАКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ SARS-COV-2 / PLATELET HYPERACTIVATION IN SARS-COV-2 INFECTION

Активация тромбоцитов при COVID-19 происходит с помощью различных механизмов, которые включают специфичный для SARS-CoV-2 механизм и фактор, опосредованный воспалением [46]. В первом случае SARS-CoV-2 поражает клетки путем связывания спайкового белка с ACE2, который экспрессирует на альвеолярных эпителиальных клетках, энтероцитах, моноцитах, тромбоцитах и эндотелиальных клетках сосудов [47]. Связывание эндотелиальных клеток со спайковым белком вируса приводит к снижению экспрессии ACE2, а далее к снижению преобразования ангиотензина II в ангиотензин 1-7. Повышение уровня ангиотензина II стимулирует сужение сосудов, а снижение уровня ангиотензина 1-7 усиливает провоспалительную реакцию и риск тромбообразования за счет сужения сосудов и адгезии лейкоцитов к тромбоцитам [48]. Более того, имеются данные о прямом вирусном заражении тромбоцитов и мегакариоцитов. Вирус SARS-CoV-2 может быть обнаружен в тромбоцитах [49], и по крайней мере одно исследование показывает, что тромбоциты не только экспрессируют ACE2 и мембраносвязанную сериновую протеазу (агнл. transmembrane protease, serine 2, TMPRSS2), но и что спайковый белок SARS-CoV-2 напрямую связывает ACE2 и усиливают активацию тромбоцитов in vitro [47]. Другие предположительные механизмы захвата SARS-CoV-2 тромбоцитами могут включать эндоцитоз с помощью TLRs, лектиноподобного рецептора-2 С-типа (англ. C-type lectin-like receptor-2, CLEC?2) или эмпериполеза мегакариоцитов [50][51].

Стимулом для активации тромбоцитов при COVID-19 также может быть рост клеток-супрессоров полиморфноядерного миелоидного происхождения [52], поскольку было обнаружено, что эти клетки сверхэкспрессируют медиаторы L-аргинина, аргиназы-1 и синтазы оксида азота (англ. NO-synthase, NOS) [53].

Другим немаловажным фактором активации тромбоцитов является продолжающееся воспаление, которое может приводить к формированию гипервоспалительного ответа. Как правило, первыми в очаг воспаления выходят нейтрофилы, они обнаруживаются в воспаленной ткани уже через 6–24 ч. Как известно, нейтрофилы являются наиболее распространенными циркулирующими лейкоцитами (40–70 % белых кровяных телец) и представляют собой первую и самую мощную клеточную линию защиты хозяина, поскольку они способны убить большинство патогенов в течение нескольких часов. Нейтрофилы представляют собой подвижные клетки, которые проникают в ткани, недоступные другим лейкоцитам [54]. Нейтрофильные механизмы уничтожения микробных патогенов включают фагоцитоз, дегрануляцию и образование активных видов кислорода и азота, а также высвобождение NETs, которые представляют собой сеть внеклеточных волокон, в основном состоящих из ДНК нейтрофилов, для уничтожения патогенных микроорганизмов [55]. Способность нейтрофилов контролируемым образом вытеснять свою ДНК во внеклеточную среду в процессе активации (нетоза), чтобы ловить и уничтожать патогенные микроорганизмы, является уникальным инструментом врожденного иммунного ответа [56]. Основной путь передачи сигнала, инициирующий нетоз, включает мобилизацию кальция, генерацию активных форм кислорода НАДФН-оксидазой (англ. NAPDH-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase), перенос из цитоплазмы в ядро нейтрофильной эластазы, миелопероксидазы (англ. myeloperoxidase, МРО), пептидил-аргинин деиминазы 4 (англ. peptidyl arginine deiminase 4, PAD4) и цитруллинирование гистонов [57].

Эксперимент на мышах показал, что гистоны и ДНК NETs активируют макрофаги и другие иммунные клетки через TLR-9 с последующей стимуляцией высвобождения фактора некроза опухоли-альфа (англ. tumor necrosis factor alpha, TNF-α), IL-6 и IL-1β с индукцией циткинового шторма [58][59] Провоспалительные цитокины приводят к неконтролируемым взаимодействиям между NETs и макрофагами с последующим прогрессирующим воспалением [60]. Неконтролируемая активация NETs может привести к чрезмерной активации макрофагов и провоспалительных цитокинов, тромбоцитов [61]. Уровни NETs в плазме крови коррелируют с вирусной нагрузкой SARS-CoV-2 и связанными с ней воспалительными цитокинами и хемокинами [62]. Кроме активации тромбоцитов, NETs влияют на различные звенья гемостаза (рис. 3) [63]. Считается, что наличие цитокинового шторма является одним из основных факторов активации тромбоцитов с помощью воспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-1β и TNF-α [64].

Гиперактивация тромбоцитов стимулирует повышенное высвобождение внеклеточных везикул α- и плотных гранул тромбоцитов в кровоток. Более того, у пациентов с COVID-19 повышается количество некоторых молекул, высвобождаемых активированными тромбоцитами, включая серотонин, растворимый Р-селектин, растворимый CD40L, фактор роста тромбоцитов (англ. platelet-derived growth factor, PDGF), PF4 и фактор фон Виллебранда (англ. von Willebrand factor, vWF) [65]. Как известно, vWF также участвует в активации тромбоцитов [66]. Высокий уровень PF4 наблюдается как в тяжелых, так и в нетяжелых случаях COVID-19, в то время как P-селектин повышается в тяжелых случаях COVID-19, в том числе осложненных респираторным дистресс-синдромом [67].

K. Althaus с соавт. в своем исследовании показали, что инкубация сывороток и фракций IgG от пациентов с тяжелой формой COVID-19 с тромбоцитами, выделенными от здоровых доноров, привела к увеличению экспресии фосфатидилсерина (англ. phosphatidylserine, PS) и увеличению цитозольного кальция. Это указывает на то, что антитела IgG, присутствующие у пациентов с тяжелой формой COVID-19, могут индуцировать прокоагулянтные реакции in vivo через рецептор FcyRIIa, что вызывает активацию и агрегацию тромбоцитов [68]. На сегодняшний день вклад прокоагулянтных тромбоцитов в риск тромбоза при COVID-19 четко не определен и, возможно, не является наиболее вредным аспектом активации тромбоцитов. Основываясь на имеющихся на сегодняшний день доказательствах, коагулопатия при COVID-19, скорее всего, является результатом тромбовоспаления, которое способствует повышению уровня Р-селектина, активации интегрина aIIbβ3 и патологическим взаимодействиям между тромбоцитами, лейкоцитами и эндотелиальными клетками [22]. Патологические уровни Р-селектина приводят к активации лейкоцитов, индуцируют экспрессию TF и стимулируют нейтрофилы к образованию NETs, что косвенно способствует гиперкоагуляции тромбоцитов [69][70].

Тромбоциты, выделенные у пациентов с COVID-19, гиперреактивны к традиционным агонистам, таким как АДФ, коллаген и тромбин, по сравнению с тромбоцитами здоровых пациентов, что указывает на сенсибилизацию тромбоцитов, вызванную вирусом. Состояние активации тромбоцитов является результатом интеграции как стимулирующих, так и ингибирующих сигнальных путей. Активация тромбоцитов при COVID-19, по-видимому, частично обусловлена увеличением таких факторов, как протеинкиназа С дельтатипа (англ. protein kinase C delta-type, PRKCD), внеклеточная сигнальная киназа и митоген-активируемая протеинкиназа p38 [71]. Другие исследователи аналогичным образом продемонстрировали повышенную активацию и агрегацию тромбоцитов в ответ на стимуляцию низкими дозами агонистов, а также усиленное высвобождение АДФ, тромбаксана А2, β-тромбоглобулина и АТФ тромбоцитами, выделенными у пациентов с COVID-19 [68]. АДФ и тромбоксан А2 действуют как местные аутокринные агонисты, которые дополнительно усиливают активацию тромбоцитов и дальнейшее высвобождение содержимого гранул [71], тем самым подпитывают состояние, при котором реактивность тромбоцитов повышается при COVID-19.

В дополнение к активации тромбоцитов стоит сказать об уникальных изменениях транскриптома, которые происходят в тромбоцитах пациентов с COVID-19. Исследование транскриптома у госпитализированных пациентов показало значительные различия в экспрессии матричной РНК (мРНК) 3325 генов по сравнению со здоровыми пациентами [72]. Другое исследование показало значительное различие в протеомике и метаболомике сыворотки крови между пациентами с тяжелой формой COVID-19 и контрольной группой, в том числе резкое снижение уровня 15 из 17 белков, участвующих в дегрануляции тромбоцитов, в частности β-тромбоглобулина и PF4 [73], что говорит о значительном изменении фенотипа тромбоцитов.

A. Kruger с соавт. в недавном исследовании показали, что гиперактивация тромбоцитов сохраняется длительнее время у пациентов с постковидным синдромом (англ. post-COVID-19 syndrome, Long COVID). Они обнаружили повышенные уровни vWF и PF4 у этих больных. Фактор фон Виллебранда может способствовать развитию коагулопатий, которые наблюдаются у пациентов с Long COVID. Также при микроскопии и протеомике была выявлена значительная гиперактивность тромбоцитов у пациентов с постковидным синдромом в отличие от здоровых, что имеет существенное значение при диагностике и терапии [74].

СВЯЗЬ ТРОМБОЦИТОВ И ИММУННЫХ КЛЕТОК ПРИ COVID-19 / AN INTERPLAY BETWEEN PLATELETS AND IMMUNE CELLS IN COVID-19

COVID-19 стимулирует не только активацию тромбоцитов, но и патологическое взаимодействие с различными иммунными клетками: моноцитами, макрофагами и нейтрофилами (рис. 4). При COVID-19 P-cелектин тромбоцитов связывает лиганды нейтрофилов [75], инициируя высвобождение NETs посредством передачи сигналов через TLR4 тромбоцитов [76] и секрецию содержимого гранул тромбоцитов [62]. Вытесненные нити хроматина обеспечивают агрегацию тромбоцитов и образование тромбов, а открытые гистоновые белки активируют тромбоциты через TLR4 и TLR2, что приводит к образованию тромбина [77]. Нейтрофильные сериновые протеазы разрушают ингибитор пути ТF, что способствует тромбообразованию. Таким образом, взаимодействие гиперреактивных тромбоцитов и нейтрофилов приводит к иммунотромбозу и накоплению NETs [78].

Повышенное образование агрегатов тромбоцитов и моноцитов было показано у пациентов с тяжелой формой COVID-19 по сравнению с пациентами с легкой формой. При стимуляции провоспалительными цитокинами моноциты являются источником прокоагуляционного ТF, который инициирует пути свертывания, опосредованные тромбином [79][80]. В исследованиях E.D. Hottz с соавт. было продемонстрировано, что моноциты, связанные с тромбоцитами, обладали повышенной экспрессией ТF по сравнению со свободными моноцитами. Более того, выделенные тромбоциты от пациентов с тяжелой формой COVID-19 вызывали экспрессию ТF в моноцитах здоровых пациентов. Адгезия тромбоцитов осуществляется через P-селектин и интегрин αIIb/β3 и является основным сигналом для секреции широкого спектра медиаторов, включая прои противовоспалительные цитокины и хемокины [81][82]. Повышенная активация тромбоцитов и экспрессия ТF моноцитами считаются предикторами неблагоприятных исходов у пациентов с COVID-19 при поступлении в отделение интенсивной терапии [83].

Тромбоциты также играют роль во врожденном иммунном ответе посредством экспрессии TLRs и в адаптивном иммунном ответе путем прямого модулирования активации лимфоцитов и MHC класса I [84][85]. Активированные тромбоциты экспрессируют функциональные молекулы MHC I, связанные с α-гранулами, которые могут представлять не только эндогенные антигены стандартным цитозольным путем, но и экзогенные антигены путем перекрестной презентации [86]. Растворимые факторы, содержащиеся в α-гранулах тромбоцитов, такие как CD40L, PF4 и трансформирующий фактор роста-бета (англ. transforming growth factor-beta, TGF-β), обладают иммуномодулирующей активностью [87]. CD40L усиливает реакции CD8+ Т-клеток, а TGF-β регулирует дифференцировку CD4+ Т-клеток, которые могут предотвращать развитие цитокинового шторма [88][89].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Осложнения, возникающие при тяжелом течении COVID-19, особенно тромботические инциденты в различных органах и системах, представляют высокий риск летального исхода. Сложность ситуации заключается в том, что клиницист встречается с поздними проявлениями заболевания, а клиническая симптоматика является следствием биологических нарушений и множественных эффектов тромбовоспаления, что требует большей диагностики и пристального внимания. Дисрегуляция тромбоцитов играет немаловажную роль при COVID-19, а спектр реакций при этом коррелирует с клиническими исходами. Тромбоцитопения связана с повышенным риском тяжелого течения COVID-19, что может служить простым биомаркером тяжести заболевания и риска смертности пациентов в отделении интенсивной терапии. Дальнейшее изучение механизмов тромбоцитопении может обеспечить ценную теоретическую основу для своевременного лечения и дать более полное понимание этого заболевания. Гиперактивация тромбоцитов вносит вклад в патогенез заболевания как за счет высвобождения медиаторов воспаления, так и за счет тромбоза. Кроме того, тромбоциты могут взаимодействовать с нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами для активации иммунного ответа. Мы считаем, что все эти особенности могут играть ключевую роль в патогенезе COVID-19.