Иммунотромбоз у онкологических больных: вклад внеклеточных ловушек нейтрофилов, ADAMTS-13 и фактора фон Виллебранда

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Нейтрофилы – наиболее многочисленная подгруппа лейкоцитов в плазме крови. Они играют критически важную роль в реакциях врожденного иммунитета и воспаления. Известно, что противомикробный эффект нейтрофилов основан на двух основных стратегиях: фагоцитоз и дегрануляция. V. Brinkmann с соавт. первыми сообщили о новой антимикробной стратегии нейтрофилов, связанной с формированием внеклеточных ловушек нейтрофилов (англ. neutrophil extracellular traps, NETs), которые представляют собой сетчатые хроматинсодержащие структуры, увешанные гистонами и гранулированными белками – протеазами, высвобождающимися из нейтрофилов во внеклеточное пространство [1][2]. В состав NETs ходят такие протеазы, как нейтрофильная эластаза (англ. neutrophil elastase, NE), миелопероксидаза (англ. myeloperoxidase, MPO), катепсин G (англ. cathepsin, CG), протеиназа-3 (англ. proteinase, PR-3), металлопротеиназа-9 (англ.

metalloproteinase-9, MMP-9) и пептид нейтрофилов человека-1 (англ. human neutrophil peptide-1, HNP-1) [3–5]. Состав, тип белков и посттрансляционные модификации NETs, синтезируемых в результате различных стимуляций, разные [6].

В настоящее время в зоне интереса находятся вопросы взаимодействия между NETs, фактором фон Виллебранда (англ. von Willebrand factor, vWF) и специфической металлопротеазой ADAMTS-13 (англ. a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif, member 13) в рамках иммунотромбоза у онкологических пациентов. Все больше исследований показывают, что NETs, также как и vWF, играют важную роль в развитии артериального [7], венозного [8] и рак-ассоциированного тромбоза [9]. NETs напрямую взаимодействуют с vWF путем электростатических взаимодействий [10], и это взаимодействие удерживает их на поверхности эндотелия [11]. NETs напрямую и косвенно снижают активность ADAMTS-13, способствуя образованию сверхкрупных мультимеров vWF (англ. ultra large, UL-vWF). Взаимодействия NETs, vWF и ADAMTS-13 могут образовывать порочный круг, усугубляя развитие тромбоза и воспаления.

Все эти данные демонстрируют необходимость анализа взаимодействий между NETs, vWF и ADAMTS-13 при раке.

Цель: оценка взаимодействия NETs, vWF и ADAMTS-13 при злокачественных новообразованиях тела матки, яичников и молочных желез, аденокарциноме цервикального канала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ / MATERIALS AND МETHODS

Дизайн исследования / Study design

С сентября 2019 г. по июль 2022 г. на базах ГБУЗ ГКОБ № 1 ДЗМ и ФГБНУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского проведено проспективное контролируемое интервенционное нерандомизированное исследование с участием 106 пациенток в возрасте от 30 до 72 лет, госпитализированных в стационар для планового оперативного лечения.

Группы обследованных / Patient groups

В основную группу вошли 73 пациентки со злокачественными новообразованиями женских половых органов и молочных желез стадий I–III: рак тела матки (подгруппа 1; n = 18), рак яичников (подгруппа 2; n = 21), рак шейки матки – аденокарцинома цервикального канала (подгруппа 3; n = 9), рак молочной железы (подгруппа 4; n = 25).

Контрольную группу составили 33 женщины с доброкачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в основную группу: наличие злокачественного новообразования яичников, тела матки, шейки матки и молочных желез, подтвержденное данными клинического и инструментального обследования; добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: наличие доброкачественного новообразования женских половых органов и молочной железы; отсутствие в анамнезе активного рака и онкологических заболеваний, тромбозов и тромбоэмболий, хронических воспалительных заболеваний; добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: наличие активного инфекционного и/или воспалительного процесса; аллергическая реакция на контрастные вещества, антикоагулянты, препараты химиотерапии; признаки тромботического или геморрагического синдрома на момент первого обследования; отказ от участия в исследовании.

Методы исследования / Study methods

Образцы плазмы получали путем венепункции до оперативного лечения и до назначения антикоагулянтов при поступлении пациента в отделение и хранили при температуре –80° С после центрифугирования. Отбор проб крови производили за сутки до операции натощак сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8 % раствор трехзамещенного цитрата натрия.

В замороженных образцах плазмы с низким содержанием тромбоцитов определяли концентрацию антигена фактора фон Виллебранда (vWF:Aг), активность ADAMTS-13 (ADAMTS-13:Aк), концентрацию антигена ADAMTS-13 (ADAMTS-13:Aг) с использованием тестов TECHNOZYM® (Technoclone Herstellung von Diagnostika und Arzneimitteln GmbH, Австрия). Согласно данным производителя, нормальным референтным диапазоном для vWF:Aг считается диапазон 0,5–1,5 МЕ/мл (50–150 %), активности ADAMTS-13 – 0,4–1,3 МЕ/мл, антигена ADAMTS-13 – 0,41–1,41 ЕД/мл.

Для определения концентрации в плазме крови антигена миелопероксидазы человека (MРO:Aг) использовали набор для иммуноферментного анализа (ИФА) Hycult Biotech, (Нидерланды), в сооветствии с которым нормальный референтный уровень МРО:Аг составляет 2,56 ± 0,33 нг/мл.

Определение цитруллинированного гистона H3 (англ. citrullinated histone H3, citH3) в плазме крови осуществляли с использованием набора для ИФА Citrullinated Histone H3 ELISA Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, США).

D-димер определяли с помощью имеющегося в продаже иммуноанализа, усиленного латексом (TECHNOLEIA®, реагент Techoclone). Концентрацию D-димера > 250 нг/мл считали патологической в соответствии с данными производителя.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проводили согласно требованиям Хельсинской декларации. Все пациентки получили исчерпывающую информацию и подписали форму информированного согласия.

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистический анализ включал в себя расчёт описательных статистик: средней (M), медианы (Ме), среднеквадратического отклонения (SD), возраста и индекса массы тела, лабораторных показателей. Оценка на нормальность распределения проводилась при помощи теста Харке–Бера (Jarque–Bera test). Нулевая гипотеза (H₀) о том, что остатки значений рассматриваемых показателей групп участников имеют нормальное распределение, была нами отклонена на уровне значимости p ≤ 0,05. Непараметрическая оценка и сравнение значений показателей между группами были проведены при помощи критерия Манна–Уитни для несвязанных выборок (Mann–Whitney U-test). Нулевая гипотеза H₀ была сформулирована нами как отсутствие различий между группами пациенток; H0 отклонялась во всех случаях при уровнях значимости p ≤ 0,05. При изучении связей между переменными с точки зрения отражения соответствующих причинноследственных отношений между значениями NETs, ADAMTS-13 и vWF проводился расчет ρ – коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Spearman Rank Order Correlations) с фиксацией уровня значимости коэффициента в корреляционной матрице. Обработку данных осуществляли с использованием специализированного программного обеспечения Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Клинико-анамнестическая характеристика обследованных пациенток / Clinical and anamnestic characteristics of patients examined

Клинико-анамнестические данные обследованных пациенток представлены в таблице 1.

Пациентки основной и контрольной групп достоверно не различались по возрасту и индексу массы тела. Обращает на себя внимание большое количество пациенток с ожирением как в основной, так и в контрольной группе, особенно среди женщин с доброкачественными и злокачественными заболеваниями молочных желез и эндометрия. В основной группе было значимо повышено количество пациенток с анемией, особенно в подгруппах рака эндометрия и рака яичников.

В таблице 2 представлены результаты изученных лабораторных показателей обследованных пациенток.

Были выявлены значимые различия в содержании citH3 и антигена МРО человека между основной и контрольной группой (рис. 1, 2). Существенные различия между группами при оценке citH3 определены между пациентками с опухолями тела матки и яичников (р = 0,0135), опухолями тела матки и молочной железы (р < 0,00001), опухолями яичников и молочной железы (р < 0,00001); максимальные значения маркеров нетоза имели пациентки с опухолями тела матки и аденокарциномой цервикального канала, и их концентрации достоверно не различались.

При этом отмечены значимые различия в концентрации citH3 среди пациенток с «ранними» (стадия I) и «не ранними» (стадия II–III) формами заболеваний (рис. 3), а существенных различий в концентрации MPO среди пациенток с «ранними» (стадия I) и «не ранними» (стадия II–III) формами заболеваний не найдено.

При оценке концентрации антигена фактора фон Виллебранда (vWF:Aг), антигена (ADAMTS-13:Aг) и активности (ADAMTS-13:Aк) ADAMTS-13 были выявлены значимые различия между основной и контрольной группой (p < 0,0001). Концентрация vWF в подгруппах основной группы была резко повышена (рис. 4) на фоне снижения концентрации антигена (рис. 5) и активности ADAMTS-13 (рис. 6). При сравнении показателей между подгруппами основной группы достоверных различий выявлено не было.

Установлены значимые различия в концентрации vWF:Aг среди пациенток с «ранними» (стадия I) и «не ранними» (стадия II–III) формами заболеваний (рис. 7).

Достоверных различий при оценке ADAMTS-13:Aг и ADAMTS-13:Aк среди пациенток с «ранними» (стадия I) и «не ранними» (стадия II–III) формами заболеваний выявлено не было.

Корреляции между содержанием маркеров нетоза, ADAMTS-13:Aк и АDAMTS-13:Аг / A correlation between NETosis markers, ADAMTS-13:Ac and АDAMTS-13:Аg Корреляционный анализ среди онкологических пациенток основной группы (рис. 8) определил, что с увеличением концентрации citH3 повышается концентрация vWF:Aг (ρ = 0,80; р < 0,01) и MПO:Aг (ρ = 0,87; р < 0,01); с ростом содержания MПO:Aг растет уровень vWF:Aг (ρ = 0,70; р < 0,01); с увеличением концентрации vWF:Aг снижаются значения ADAMTS-13:Aк (ρ = –0,43; р < 0,01) и ADAMTS-13:Aг (ρ = –0,42; р < 0,01).

Корреляционный анализ среди пациенток из подгруппы 2 (рак яичника) показал (рис. 9), что с ростом концентрации MРO:Aг снижаются значения ADAMTS-13:Aк (ρ = –0,58; р < 0,01) и ADAMTS-13:Aг (ρ = –0,60; р < 0,01), а также с увеличением концентрации citH3 снижаются уровни ADAMTS-13:Aк (ρ = –0,62; р < 0,01) и ADAMTS-13:Aг (ρ = –0,69; р < 0,01).

С увеличением концентрации citH3 повышается концентрация vWF:Aг (ρ = 0,76; р < 0,01); с увеличением концентрации vWF:Aг снижаются значения ADAMTS-13:Aк (ρ = –0,84; р < 0,01) и ADAMTS13:Aг (ρ = –0,86; р < 0,01).

Корреляционный анализ среди пациенток подгруппы 3 (рак шейки матки) показал корреляцию между уровнями citH3 и vWF:Aг (ρ = 0,83; р < 0,01) и citH3 и MРO:Aг (ρ = 0,84; р < 0,01). Обнаружена корреляционная зависимость в подгруппе 4 (рак молочной железы), где с увеличением концентрации citH3 повышалась концентрация vWF:Aг (ρ = 0,74; р < 0,01).

При оценке уровня Д-димера было выявлено значимое его повышение во всех подгруппах основной группы относительно контрольной, однако корреляционных связей с остальными изученными показателями установлено не было.

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

За последнее десятилетие исследования показали, что NETs способствуют тромбообразованию, формированию и распространению артериальных, венозных и опухолевых тромбов. Взаимодействие между NETs и vWF приводит к формированию более крупных сетей, ускоряющих процессы иммунотромбоза при различных заболеваниях.

Как NETs, так и vWF являются участниками тромбоза и воспаления у онкологических больных. В ходе этих процессов происходит сложный ряд событий, включая активацию эндотелия, образование NETs, секрецию vWF и адгезию клеток крови, агрегацию и активацию тромбоцитов. Активность мультимеров vWF регулируется специфической металлопротеазой ADAMTS-13.

Механизмы формирования NETs / Mechanisms of NETs formation

К синтезу NETs, так называемому нетозу, приводят такие стимулы, как бактерии, грибы, вирусы, активированные тромбоциты, а также химические стимулы [4]. Механизм образования NETs сложен и до сих пор не до конца изучен [10]. Нетоз сопровождается дезорганизацией актина с последующим разрушением плазматической мембраны, формированием микровезикул, ремоделированием виментина, дезорганизацией микротрубочек, везикуляцией эндоплазматического ретикулума, деконденсацией хроматина, увеличением проницаемости плазматической мембраны и ядерной оболочки, а затем разрывом ядерной оболочки с освобождением хроматина в цитоплазму и, наконец, разрывом плазматической мембраны и выбросом внеклеточного хроматина. Данный механизм имеет место при суицидальном нетозе. В отличие от суицидального, при витальном нетозе нейтрофилы не подвергаются лизису и продолжают функционировать [11]. Помимо хромосомной ДНК, митохондриальная ДНК представляет собой еще один источник NETs при митохондриальном нетозе [12].

Механизмы NETs-индуцированного тромбоза / Mechanisms of NETs-induced thrombosis

В последние годы NETs были признаны важными участниками процесса тромбообразования, они обнаруживаются в тромбах у пациентов с венозным и артериальным тромбозом [13]. Протромботический эффект NETs проявляется в усилении агрегации тромбоцитов; NETs формируют каркас для привлечения эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов, а также для связывания белков плазмы, таких как vWF и фибронектин [14]. Этот каркас также способствует отложению фибрина. Два основных компонента NETs – ДНК и гистоны активируют коагуляционный каскад. ДНК NETs способствует формированию тромбина в FXIIили FXI-зависимом пути [15]. Гистоны индуцируют синтез тромбина путем активации тромбоцитов через толл-подобные рецепторы (англ. toll-like receptors, TLRs) TLR2 и TLR4 независимо от FXII [14]. Кроме того, гистоны, особенно Н4, непосредственно взаимодействуют с тромбоцитами и активируют интегрин aIIbb3 на поверхности тромбоцитов, вызывая последующую агрегацию тромбоцитов, опосредованную фибриногеном [16]. Гистоны вызывают серьезное повреждение тканей и тромбоцитопению, а также индуцируют гибель мышей в эксперименте, которая предотвратима с использованием гепарина [16]. Сериновые протеазы NE и CG запускают путь тканевого фактора (англ. tissue factor, TF) и FXII-зависимую коагуляцию [17]. Неконтролируемое образование NETs приводит к повреждению тканей в результате активации воспалительных реакций, способствуя развитию фиброза [18], сепсиса [19], метастазирования опухолей [3], системных воспалительных заболеваний [18], тромбозу [20] и атеросклерозу.

Тканевой фактор является ключевым инициатором внешнего пути свертывания [21]. Нейтрофилы прикрепляются к эндотелию за счет взаимодействия антигена функции лейкоцитов-1 (англ. leukocyte function antigen-1, LFA-1) и молекулы межклеточной адгезии-1 (англ. intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1), способствуя дальнейшей экспрессии TF и стимулируя образование фибрина и агрегацию тромбоцитов [22]. Повышенная экспрессия TF и высвобождение NETs с тканевым фактором в составе были обнаружены у пациентов с сепсисом [23], острым инфарктом миокарда [24][25], системной красной волчанкой [26] и COVID-19 [25]. В патогенезе этих заболеваний нейтрофилы выступают в роли источника TF.

Взаимодействие между тромбоцитами и нейтрофилами играет важную роль в развитии NETs-индуцированного тромбоза. Тромбоциты, взаимодействуя с нейтрофилами, приводят к активации нетоза посредством вовлечения комплекса P-селектина/PSGL-1 (англ. P-selectin glycoprotein ligand-1; гликопротеиновый лиганд P-селектина 1), связывания β₂-интегринов нейтрофилов с гликопротеином GPIba на поверхности тромбоцитов [27], высвобождая растворимые медиаторы, такие как тромбоцитарный фактор 4/хемокиновый лиганд 4 (С-Х-С мотив) (англ. platelet factor 4/chemokine ligand 4 (C-X-C motif), PF4/CXCL4) [28] и белок 1 высокомобильной группы (high-mobility group protein box 1, HMGB1) [29]. HMGB1 усиливает привлечение нейтрофилов и нетоз [30]; NETs в свою очередь привлекают и активируют больше тромбоцитов. Повышая экспрессию тромбоцитарного P-селектина или путем активации TLR2 и TLR4 [31], гистоны способствуют активации тромбоцитов. Гистоны вызывают агрегацию тромбоцитов путем стимуляции притока ионов кальция и привлечения белков адгезии плазмы [16].

Фактор фон Виллебранда и ADAMTS-13 / von Willebrand factor and ADAMTS-13

Фактор фон Виллебранда – гликопротеин, выделяемый эндотелием [32]. Длинные мультимеры vWF, особенно UL-vWF, проявляют протромботическую активность. Гликопротеин vWF связывает циркулирующие тромбоциты в местах повреждения сосудов и способствует их последующей активации и агрегации [33]. Активность vWF зависит от его размера. Сверхбольшие мультимеры vWF (UL-vWF), высвобождаемые эндотелиальными клетками, могут спонтанно рекрутировать избыточное количество циркулирующих тромбоцитов и других клеток крови, способствуя развитию тромбоза.

Работа vWF регулируется металлопротеазой ADAMTS-13, которая специфически расщепляет пептидную связь Tyr1605-Met1606 в домене А2. Мультимеризация vWF и протеолиз ADAMTS-13 протекают параллельно, что позволяет контролировать размер мультимеров vWF, обеспечивая адекватную адгезию, активацию и агрегацию тромбоцитов. Три домена – A1-A2-A3 необходимы для функционирования vWF, так как они содержит участки связывания GPIba с тромбоцитами (A1), коллагеном субэндотелиального матрикса (А1 и А3) и пептидную связь, расщепляемую ADAMTS-13 (A2). В исследованиях было показано, что vWF участвует также и в привлечении лейкоцитов. Активированные тромбоциты на UL-vWF опосредуют рекрутирование лейкоцитов [2]. Домен D’D3 фактора фон Виллебранда связывается с PSGL-1 лейкоцитов, а также взаимодействует с лейкоцитарным интегрином b2 [34]. При наличии инфекционных агентов мультимеры vWF также связываются с NETs, формируя сеть, которая может привлекать как тромбоциты, так и лейкоциты, способствуя развитию тромбоза [35]. Размер таких тромбов эффективно контролируют ADAMTS-13 и ДНКаза I [36][37]. ADAMTS-13 расщепляет мультимеры vWF, в то время какДНКаза I расщепляет ДНК NETs.

Металлопротеаза ADAMTS-13 расщепляет большие мультимеры vWF на мелкие [38]. Тяжелый дефицит ADAMTS-13 приводит к развитию тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП) – заболеванию, характеризующемуся системным микрососудистым тромбозом [39]. ADAMTS-13 представляет собой многодоменный белок, включающий металлопротеазный домен (M), дизинтегриноподобный домен (D), домен тромбоспондина типа 1 (T), домен, богатый цистеином (C), спейсерный домен (S), за которым следуют 7 дополнительных повторов тромбоспондина типа 1 (T2–8) и два CUB (англ. c1r/c1s complement, sea urchin epidermal growth factor, and bone morphogenetic protein; комплемент c1r/c1s, эпидермальный фактор роста морского ежа и костный морфогенетический белок) [40][41]. Различные домены ADAMTS-13 связываются с vWF. Отсутствие спейсерного домена приводит к драматическому снижению его протеолитической активности, а значит, наличие спейсерного домена является жизненно важным [42].

Взаимодействия NETs, vWF и ADAMTS-13: формирование порочного круга / Interplay between NETs, vWF and ADAMTS-13: emerging vicious cycle

Свободно циркулирующая ДНК может напрямую связываться с доменом A1 фактора фон Виллебранда посредством электростатического взаимодействия [43], которое блокируется гепарином [44]. Это взаимодействие не препятствует расщеплению vWF посредством ADAMTS-13. Преинкубация с ДНК значительно ухудшает адгезию тромбоцитов на поверхности vWF, что указывает на то, что ДНК блокирует сайт связывания GPIba в домене A1 фактора фон Виллебранда [34, 44].

Нейтрофильная эластаза NETs, содержащая положительно заряженные фрагменты [45], также способна связываться с vWF посредством электростатического взаимодействия. Фактор фон Виллебранда является ключевым медиатором для рекрутирования лейкоцитов в места повреждения сосудов [46]; vWF клеточного происхождения и vWF тромбоцитарного происхождения также связываются с сетями. Исследования показали, что синтез тромбоцит-индуцированных NETs подавляется при блокировании выделения vWF активированными тромбоцитами [28]. Исследователи предположили, что vWF тромбоцитарного происхождения может быть связующим звеном между активированными тромбоцитами, нейтрофилами и тромбоцит-индуцированным нетозом.

В предыдущих исследованиях уже было показано, что и vWF и NETs обладают провоспалительным эффектом [47][48]. NETs, связанные с vWF, привлекают большее количество лейкоцитов к активированному эндотелию, усиливая инфильтрацию лейкоцитов в окружающие ткани и усиливая провоспалительные эффекты NETs. Таким образом, vWF, высвобождаемый из эндотелиальных клеток и тромбоцитов, взаимодействует с NETs, способствуя прогрессированию тромбоза и воспаления.

NETs модулируют активность как vWF, так и ADAMTS-13. Снижение активности ADAMTS-13 одновременно с повышением концентрации vWF в плазме крови наблюдается при тромботических микроангиопатиях (ТМА), связанных с системным воспалением, например, при тяжелом сепсисе, сепсис-индуцированном диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови (ДВС-синдром), злокачественных новообразованиях, аутоиммунных заболеваниях [49].

Активированные нейтрофилы и NETs способствуют образованию дефицита ADAMTS-13. При системном воспалительном ответе активированные нейтрофилы и NETs выделяют различные цитокины, протеазы, пептиды и реактивные формы кислорода, такие как перекись водорода (H₂O₂) и хлорноватистая кислота (HOCl). Было показано, что некоторые провоспалительные цитокины регулируют высвобождение и расщепление мультимеров vWF в кровотоке [50]. Интерлейкин (англ. interleukin, IL) IL-8, фактор некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor alpha, TNF-α) и комплекс IL-6/IL-6-рецептор стимулируют высвобождение мультимеров vWF и его связывание с тромбоцитами на поверхности эндотелиальных клеток. IL-6 подавляет расщепление мультимеров vWF протеазой ADAMTS-13. У пациентов с сепсис-индуцированным ДВС-синдромом в плазме крови определяются низкомолекулярные формы ADAMTS-13, что указывает на связь дефицита ADAMTS-13 больше с протеолизом протеазы в плазме, чем с нарушением ее биосинтеза [51]. Нейтрофильная эластаза и плазмин инактивируют ADAMTS-13 путем протеолиза in vitro [51][52]. Миелопероксидаза катализирует образование HOCl из H₂O₂ и Cl^–, что приводит к окислительному повреждению тканей [53]. HOCl окисляет Met1606 в A2 домене vWF в сайте расщепления ADAMTS-13, превращая метионин в сульфоксид метионина. Окисленный субстрат становится менее доступным для расщепления протеазой ADAMTS-13 [54]. Интересно, что HOCl, генерируемая MPO-H₂O₂-Cl^––системой, окисляет и метионин в ADAMTS-13, значительно снижая ее способность расщеплять мультимеры vWF [55]. Таким образом, как субстрат vWF, так и ADAMTS-13 могут окисляться системой MPO-H2O2-Cl–, высвобождаемой из активированных нейтрофилов и при нетозе, что ведет к снижению активности ADAMTS-13 и повышению концентрации мультимеров vWF в плазме, что в конечном итоге приводит к усилению агрегации тромбоцитов и повышенному микротромбообразованию.

Пептиды нейтрофилов человека (англ. human neutrophil peptides, HNPs), также известные как альфадефенсины, играют важную роль в иммунных реакциях [56]; они обладают не только провоспалительным эффектом, но и прокоагулянтным за счет активации тромбоцитов [57] и гипофибринолитическим [58]. HNPs, высвобождаемые из активированных нейтрофилов и при нетозе, модулируют активность как vWF, так и ADAMTS-13. HNPs на конкурентной основе связываются с A2 доменом vWF и блокируют взаимодействие между ADAMTS-13 и vWF. Повышение концентрации HNPs в плазме крови наблюдается у пациентов с острой ТТП, что говорит о прямой связи между воспалением и дефицитом ADAMTS-13 при острой ТТП [56].

При формировании NETs пептидил-аргинин деиминаза 4 (англ. peptidyl arginine deiminase 4, PAD4) преобразует остатки аргинина в гистонах до остатков цитруллина [59]. PAD4 впоследствии необходима для деконденсации хроматина, высвобождаемого с NETs. Недавно было показано, что PAD4 способна цитруллинировать ADAMTS-13 плазмы на специфические остатки аргинина, что приводит к резкому снижению ферментативной активности ADAMTS-13 [60], при этом уменьшая время свертывания. Цитруллинированная ADAMTS-13 была обнаружена и в плазме крови пациентов с сепсисом [60].

С одной стороны, компоненты NETs подавляют активность ADAMTS-13 за счет окисления, цитруллинирования, протеолиза или конкурентного связывания с субстратом vWF A2, что приводит к увеличению концентрации антигена vWF, способствуя образованию мультимеров UL-vWF и их протромботическим эффектам. С другой стороны, как и ADAMTS-13, несколько протеаз NETs расщепляют vWF, проявляя свой антитромботический эффект. Однако их роль in vivo пока не определена. Изучение этих процессов позволяет пролить свет на взаимосвязь между воспалением, дефицитом ADAMTS-13 и ТМА. Взаимодействие между NETs и vWF подтверждается большим количеством компонентов NETs и активированных нейтрофилов на поврежденной стенке сосуда в непосредственной близости от vWF.

Это взаимодействие NETs-vWF может приводить к формированию порочного круга: опосредованный компонентом NETs дефицит ADAMTS-13 способствует образованию мультимеров UL-vWF, которые в свою очередь привлекают и присоединяют больше активированных нейтрофилов и компонентов NETs к стенке сосуда, усугубляя воспалениe и тромбоз. Таким образом, введение рекомбинантного человеческого ADAMTS-13 и/или ДНКазы I, возможно, является потенциальной терапевтической стратегией лечения ТМА и других системных воспалительных и тромботических осложнений, в том числе и у онкологических пациентов.

Возможные стратегии терапии / Potential therapeutic strategies

NETs и vWF играют решающую роль в патофизиологии острого ишемического инсульта (ИИ), который является основной причиной смерти во всем мире [61]. Большое количество активированных нейтрофилов и NETs выявлено в тромбах, извлеченных у пациентов с ИИ [62]. Разрушение NETs с помощью ДНКазы I или профилактика нетоза под действием Cl-амидина (ингибитора PAD4) значительно снижало интенсивность артериального тромбоза и способствовало поддержанию базального уровня кровотока на мышиных моделях [63]. Недавние клинические исследования также подтвердили, что NETs повышает компактность и стабильность инсультных тромбов, что затрудняет реканализацию сосудов и приводит к худшему клиническому исходу [64].

Фактор фон Виллебранда встраивается в фибриновые сети посредством ковалентного сшивания фактором XIIIa [65] или тромбинзависимым образом [66]. Инфузия рекомбинационного человеческого ADAMTS-13 растворяет устойчивые к тканевому активатору плазминогена (англ. tissue plasminogen activator, t-PA) тромбы и уменьшает размеры участков инфаркта головного мозга на модели мышей [67]. Ориентация на ось NETs–vWF кажется многообещающей и эффективной стратегией внутривенной тромболизисной терапии.

В совокупности и NETs и vWF могут привлекать тромбоциты и лейкоциты, способствуя гиперкоагуляции и лейкоцитарной инфильтрации. Bзаимодействие NETs–vWF приводит к формированию более крупной и стабильной структуры, привлекающей клетки крови и факторы коагуляции в места повреждения сосудов, облегчая взаимодействия между тромбоцитами/лейкоцитами/NETs/фибрин/vWF и способствуя развитию иммунотромбоза.

Возможно, взаимодействие между NETs и vWF способствует артериальным и венозным тромбозам, поддержанию провоспалительного статуса и прогрессированию онкологического процесса. В нашем исследовании было показано достоверное повышение маркеров нетоза у онкологических больных. Активированные нейтрофилы и NETs могут вызывать снижение активности ADAMTS-13, что в данном исследовании подтверждено выявленной корреляционной зависимостью. Чрезмерная активация гранулоцитов с высвобождением протеолитических ферментов увеличивает выделение высокомолекулярного vWF, содержащихся в тельцах Вейбеля–Паладе, что превосходит регуляторную способность молекул ADАМТS-13, на фоне чего происходит снижение концентрации антигена ADAMTS-13. Результаты проведенного исследования показывают, что у онкологических пациентов в циркулирующей крови содержание антигена vWF, МPО и citH3 существенно повышено; при этом с утяжелением стадии заболевания оно значимо растет, что отражает нарастание интенсивности процессов иммунотромбоза. Параллельно отмечено снижение значений ADAMTS-13:Аг и ADAMTS-13:Ак.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Изучение патогенеза иммунотромбоза находится в захватывающей фазе накопления знаний. Бoльшая часть литературы в основном фокусируется на том, какие стимулы могут приводить к нетозу при различных заболеваниях и состояниях, какие субстанции подавляют этот процесс. Необходимы дальнейшие исследования для выявления того, все ли популяции нейтрофилов обладают одинаковыми способностями генерировать сети в ответ на раздражители и для оценки физиологического значения нетоза.

Взаимодействие между NETs, vWF и ADAMTS-13 приводит к формированию порочного круга, снижает активность ADAMTS-13, повышая концентрацию vWF в плазме крови, что положительно коррелирует с тяжестью и смертностью при ТМА, остром ишемическом инфаркте, у онкологических пациентов и при COVID-19. Ориентация на ось NETs–vWF может проложить новый путь к терапевтическим стратегиям иммунотромбоза при различных заболеваниях, включая онкологические. В перспективе интересным является вопрос изучения взаимосвязи vWF и MРO с содержанием циркулирующих провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8 и TNF-α. Необходимы дальнейшие проспективные многоцентровые исследования с целью подтверждения полученных данных. Такие исследования могут явиться основой для старта разработок новых терапевтических стратегий. Применение ДНКазы I и ADAMTS-13 является новой потенциальной стратегией терапии. Необходимо проведение дальнейших исследований с последующей разработкой новых препаратов, избирательно воздействующих на связывание NETs–vWF, что может иметь решающее значение для пациентов с приобретенной ТТП.