Исследование генетической предрасположенности к преждевременному снижению овариального резерва

Введение / Introduction

В последние годы имеется стойкая тенденция к увеличению возраста деторождения, при этом отмечено ухудшения гинекологического здоровья женщин репродуктивного возраста в России [1]. Как следствие, наблюдается рост женского бесплодия и увеличивается востребованность вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2].

Важным фактором для успеха программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является овариальный резерв (ОР) – функциональный резерв яичников, который определяет способность к развитию фолликула с полноценной яйцеклеткой и к адекватному ответу на введение индукторов овуляции [2][3]. Полноценный ОР в программах ВРТ в значительной степени определяет их успешность. Чаще низкий ОР встречается в позднем репродуктивном возрасте, но в некоторых случаях эта проблема имеет место и у молодых женщин [2][4].

Снижение ОР может быть обусловлено многими факторами, среди которых генетические, инфекционно-токсические, аутоиммунные, психологические, а также ятрогенные. В ряде случаев наблюдается сочетание нескольких причин [5]. Тем не менее ведущим фактором сниженного ОР является старший репродуктивный возраст женщины [2][3]. У большинства женщин резко увеличивается частота элиминации фолликулов в возрасте около 38 лет, и после 40 лет наблюдается сниженный ОР [3][6]. Но под воздействием генетических и средовых факторов снижение ОР может происходить в более молодом возрасте, т. е. происходит преждевременное снижение ОР.

Однако в последнее время снижение ОР встречается и у молодых женщин. По-видимому, основной причиной преждевременного снижения ОР у молодых пациенток является генетическая предрасположенность [3][7][ 8]. Поэтому определение генов-кандидатов, ассоциированных со сниженным ОР, является перспективным методом ранней диагностики данного состояния [7].

В современной научной литературе описано множество генов, наличие полиморфизмов в которых может потенциально влиять на репродуктивную функцию [9], некоторые из них могут рассматриваться в качестве маркеров преждевременного снижения ОР. В частности, одними из хорошо изученных генов являются гены эстрогеновых рецепторов (ESR1 и ESR2), которые играют ключевую роль в фертильности женщины, регулируя действие эстрогенов во всех репродуктивных тканях человека. Гены ESR1 и ESR2 содержат несколько полиморфизмов, которые могут влиять на риск некоторых гинекологических заболеваний, связанных с бесплодием, и исход ЭКО [10]. Есть данные, что некоторые полиморфные варианты гена ESR1 (например генотип T/T, полиморфизм С-397Т) ассоциированы с неудачными исходами стимуляции суперовуляции и программы ЭКО в целом; женщины с генотипом С/С ESR1, напротив, в программах ЭКО демонстрируют созревание большего числа фолликулов, высокую степень зрелости ооцитов и хорошее качество эмбрионов при прочих равных условиях [10– 12]. При этом в ряде работ других авторов такой связи выявлено не было [13][14].

Также противоречивые данные получены при изучении влияния полиморфизма гена ESR2 на результаты стимуляции функции яичников. Некоторые исследователи утверждают, что у пациенток, имеющих гомозиготный полиморфизм А/А гена ESR2 (rs4986938), ответ на овариальную стимуляцию был хуже, им требовались большие дозы препарата фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) [15]. Другие же авторы не выявили никакого влияния полиморфизма гена ESR2 на результаты ЭКО [13][14].

Наиболее изученным к настоящему времени является ген рецептора ФСГ – FSHR (англ. folliclestimulating hormone receptor), имеющий важное значение при стимуляции суперовуляции [13][16]. Известно, что физиологическое действие ФСГ зависит от активации его рецептора, который экспрессируется гранулезными клетками [13]. Предполагается, что наличие полиморфизма в гене FSHR может привести к нарушению оогенеза и снижению числа созревающих фолликулов в программах ВРТ [17].

Множество зарубежных работ посвящено изучению гена CYP19A1, который кодирует фермент ароматазу (цитохром 19А1). Фермент ароматаза необходим для реакции биосинтеза эстрогенов из предшественников андрогенов в яичниках и экстрагонадных тканях [18]. Есть данные о его взаимосвязи с эстроген-зависимыми заболеваниями [19]. Соответственно, данный ген также может влиять на функцию яичников и овариальный ответ, особенно во взаимодействии с другими генами [18][20].

Учитывая вышесказанное, возникает необходимость дальнейшего изучения полиморфизма генов для оценки риска генетической предрасположенности к преждевременному снижению ОР.

Цель: определение генетической предрасположенности к преждевременному снижению ОР и создание на основании полученных результатов прогностической модели.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ / MATERIALS AND METHODS

Дизайн исследования / Study design

На базе кафедры акушерства и гинекологии, трансфузиологии ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России и ООО Медико-фармацевтического центра «Гармония» в 2020–2021 гг. проведено ретроспективное когортное сравнительное исследование.

Обследовано 2 группы пациенток, получавших лечение бесплодия с использованием процедур ВРТ со стимуляцией овуляции: 100 пациенток с преждевременным снижением ОР составили группу 1, 100 пациенток с нормальным ОР – группу 2. Под термином «преждевременное снижение овариального резерва» понимали клиническую ситуацию, при которой у женщин, страдающих бесплодием в возрасте до 40 лет, имелись инструментальные критерии, соответствующие низкому количеству яйцеклеток, в частности, уровень антимюллерова гормона (АМГ) < 1,2 нг/мл и/или количество антральных фолликулов (КАФ) < 5, при этом регистрировался бедный ответ на стимуляцию в программе ЭКО (< 4 ооцитов).

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения в группы определены согласно Болонским критериям и рекомендациям группы POSEIDON [21][22].

Критерии включения: возраст 30–40 лет; наличие показаний для проведения ЭКО; подписанное информированное согласие.

Критерии невключения: возраст менее 30 или более 40 лет; наличие тяжелой экстрагенитальной патологии; оперативное вмешательство на яичниках в анамнезе; эндометриоидные кисты яичников; аномальный кариотип у пациентки; наличие эндокринопатии (сахарный диабет 1-го типа); синдром поликистозных яичников; перенесенный эпидемический паротит; лучевая или химиотерапия в анамнезе.

Критерии исключения: возникновение тяжелого заболевания, возникшего в процессе обследования; отказ пациентки от участия в исследовании. Были сформированы 2 группы: в группу 1 вошли пациентки с уровнем АМГ < 1,2 нг/мл, КАФ < 5; ответом на стимуляцию в программе ЭКО < 4 ооцитов; группу 2 составили женщины с уровнем АМГ ≥ 1,2 нг/мл, КАФ ≥ 5; ответом на стимуляцию в программе ЭКО ≥ 4 ооцитов.

Методы исследования / Study methods

Всем пациенткам проведено молекулярно-генетическое исследование. Для исследования использовали соскоб буккального эпителия. Полученный материал исследовали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦРРВ) на детектирующем амплификаторе ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия) с использованием реагентов и протоколов того же производителя.

Исследование уровня гормонов, которое осуществляли стандартно в утреннее время, натощак на 2–3-й день спонтанного менструального цикла, включало определение значений ФСГ и АМГ. ФСГ определяли на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite 2000 Systems с использованием диагностических наборов реагентов (Siemens, Великобритания). Уровень АМГ определяли хемилюминесцентным методом на иммунохимическом анализаторе DXi Beckman Coulter (Beckman Coulter, США) с использованием реагентов Access AMH (Beckman Coulter, США).

Исследованные гены представлены в таблице 1.

Для анализа распределения полиморфных генотипов и аллелей исследуемых генов использовались общая, доминантная и мультипликативные модели анализа. При анализе с использованием общей модели оцениваются частоты мажорного гомозиготного, гетерозиготного и полиморфного гомозиготного генотипов. При использовании мультипликативной модели оценивается частота каждого вариантного аллеля. Доминантная модель предполагает, что полиморфный аллель является доминантным, и, следовательно, его значение проявляется при как при гомо-, так и при гетерозиготном носительстве, соответственно частота гетерозигот и полиморфных гомозигот оценивается суммарно.

Этические аспекты / Ethical aspects

Дизайн исследования утвержден локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России, протокол № 3 от 19.03.2021. Все процедуры и манипуляции, выполненные в данном исследовании, соответствовали этическим стандартам Хельсинской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям и сопоставимым нормам этики. Все обследованные женщины подписывали информированное согласие до начала исследования.

Методы статистического анализа / Statistical analysis

Для анализа межгенных сочетаний использовали компьютерный анализ методом многофакторного уменьшения размерности (англ. multifactor dimensionality reduction, MDR) с помощью компьютерной программы MDR 2.0 (Source Forge, США). Для оценки вклада каждого отдельного признака (генотипа, сочетания генотипов) в итоговый клинический фенотип использовали показатель энтропии (I).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Клиническая характеристика обследованных пациенток / Clinical characteristics of the patients examined

Таким образом, по основным клиническим параметрам группы были сопоставимы между собой.

В группе 1 был выявлен низкий уровень АМГ, который составил в среднем 0,98 [ 0,53–1,29] нг/мл, в то время как в группе 2 – 3,3 [ 1,25–5,57] нг/мл (р < 0,001). Уровень ФСГ в группах 1 и 2 также значимо различался и был соответственно 7,55 [ 6,2– 11,4] МЕ/мл и 6,30 [ 5,32–8,10] МЕ/мл (р < 0,001).

Результаты анализа распределения генотипов в исследуемых группах (общая и доминантная модели) представлены в таблице 2.

Далее мы провели анализ с помощью мультипликативной модели. Результаты представлены в таблице 3.

При использовании мультипликативной модели значимых различий между исследуемыми группами не выявлено.

Далее мы провели оценку межгенных взаимодействий и сочетаний полиморфных генотипов с помощью MDR-анализа. Результаты двухлокусного анализа проиллюстрированы на рисунке 1.

Наиболее значимые межгенные сочетания, для которых получены статистически значимые различия, представлены в таблице 4.

Далее мы провели построение трехлокусной и четырехлокусной модели. Наиболее эффективной оказалась трехлокусная модель, включающая гены ESR1, FSHR и CYP19A1 (рис. 2).

Графическое изображение характера взаимодействия полиморфных локусов при преждевременной недостаточности яичников представлено на рисунке 3. Для построения представленной модели использовался метод энтропического моделирования [24][25]. Показатель энтропии указывает силу влияния отдельных генотипов и их сочетаний на реализацию клинического фенотипа – наибольшее влияние имеют показатели с максимальным уровнем энтропии (%).

Анализ уровня энтропии показал, что наиболее весомый вклад в преждевременное снижение ОР вносит ген CYP19A1 (I = 2,7 %). Наибольшим синергичным эффектом обладают комбинации CYP19A1 и FSHR (I = 5,8 %) и ESR1 и ESR2 (I = 3,81 %), умеренный вклад вносит комбинация FSHR и ESR2 (I = 1,39 %).

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

В научных базах данных на сегодняшний день имеется множество исследований, посвященных генетической предрасположенности к нарушению репродуктивной функции и, в частности, к преждевременному снижению ОР [9][15][26][27]. Однако результаты проведенных исследований неоднозначны, ни для одного полиморфного варианта не получено убедительных доказательств касательно его вклада в формирование преждевременного снижения ОР и бедного овариального ответа.

На наш взгляд, проблему составляет тот факт, что на итоговый клинический фенотип влияет множество факторов, как генетических, так и средовых. Поэтому роль каждого отдельного гена может быть не слишком значимой [28]. Мы полагаем, что в прогнозировании мультифакторной патологии, к которой, безусловно, относится бесплодный брак, более эффективными будут мультилокусные модели, учитывающие воздействие сразу нескольких генетических вариантов.

Наше исследование подтвердило это предположение в отношении преждевременного снижения ОР. При анализе отдельных генов мы получили значимые различия только для гена CYP19A1 – гомозиготный вариант АА, который чаще встречался в группе 1, т. е. у пациенток с низким ОР.

Данные, полученные при использовании метода энтропического моделирования, показали, что наибольшим синергичным эффектом обладает комбинация CYP19A1 и FSHR (I = 5,8 %). Такая ассоциация имеет синергичный ответ и свидетельствует о том, что пациентки будут иметь с большей вероятностью низкий ответ яичников, что подтверждается также и в зарубежных исследованиях [20].

Также в нашем исследовании показано, что умеренный вклад в развитие субнормального овариального ответа, который приводит к снижению качества и количества ооцитов во время ВРТ, вносит и комбинация FSHR и ESR2 (I = 1,39 %), что нашло подтверждение в работе А.М. Sindiani с соавт. [29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Существующие в настоящее время маркеры преждевременного снижения ОР, такие как возраст женщины, уровни АМГ и ФСГ, число антральных фолликулов не всегда способны служить предикторами сниженной фертильности женщины и адекватного ответа на стимуляцию овуляции в программах ЭКО. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что разработка генетических маркеров преждевременного снижения ОР является перспективной предпосылкой для индивидуальной оценки ОР. Проведенный нами мультилокусный анализ и разработанная прогностическая модель сниженного ОР на основании сочетания сразу нескольких вариантов полиморфных генов позволит оценить риски преждевременного снижения ОР, скорректировать репродуктивные планы пациентки и персонифицировать проведение программ ВРТ в случае необходимости.