Роль тромбоцитов в противовирусном иммунитете

Биология тромбоцитов / Platelet biology

Тромбоциты представляют собой мелкие безъядерные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, которые играют ключевую роль в первичном гемостазе. Фрагментация мегакариоцитов является процессом, регулируемым связыванием тромбопоэтина с его рецептором [1]. В тромбоците нет ядра, однако он богат митохондриальной ДНК и РНК, последняя ответственна за синтез белка [2]. В организме человека циркулирует около 750 млрд тромбоцитов, ежедневно образуется около 200 млрд новых клеток в костном мозге [3] и легких [4]. Циркуляция тромбоцитов продолжается 10 дней, после чего они утилизируются печенью и селезенкой. По мере старения тромбоцит постепенно утрачивает сиаловую кислоту мембраны и снижает накопление тромбопоэтина.

За последние годы появилось все больше данных о роли тромбоцитов в таких патологических процессах, как аутоиммунные реакции [5], опухолевый рост [6] и инфекционный процесс [7]. Небольшие молекулы, нуклеиновые кислоты, липидные медиаторы и белки хранятся в различных типах органелл тромбоцита – альфа-гранулах, плотных гранулах и лизосомальных везикулах [8]. После активации тромбоциты претерпевают резкие изменения формы и высвобождают эти факторы во внеклеточную среду в их растворимом виде или заключенными в биоактивные микровезикулы [9]. Способность тромбоцитов участвовать в иммунных реакциях осуществляется благодаря выбросу различных провоспалительных и биоактивных молекул, хранящихся в их гранулах. Выбрасываемые медиаторы привлекают и модулируют активность циркулирующих лейкоцитов [10]. Тромбоциты, помимо всего прочего, выступают в качестве независимых иммунных эффекторных клеток [11]. Мегакариоциты и тромбоциты экспрессируют несколько иммуноассоциированных молекул и рецепторов, включая Fc-рецепторы [12], рецепторы комплемента [13], хемокиновые рецепторы [14] и ряд toll-подобных рецепторов (англ. toll-like receptors, TLRs) [15].

Тромбоциты и иммунный ответ / Platelets and immune response

Тромбоциты содержат различные мембранные рецепторы, способные обнаруживать патоген-ассоциированные молекулярные фрагменты молекул (англ. pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) и молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями (англ. damage-associated molecular patterns, DAMPs), например, TLRs [16]. Помимо прямого связывания с патогенами, тромбоциты участвуют в элиминации патогенов, координируя активность иммунных клеток, таких как нейтрофилы, которые связываются с активированными тромбоцитами через гликопротеиновый лиганд-1 P-селектина (англ. P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1, CD162) и мигрируют в очаги воспаления [17]. Это же взаимодействие приводит к образованию нейтрофильных везикул c арахидоновой кислотой, которые быстро интернализуются тромбоцитами через антиген макрофагов-1 (англ. macrophage-1 antigen, Mac-1). Попав внутрь, арахидоновая кислота преобразуется в тромбоксан А2 (англ. thromboxane A2, ТХА2). Затем TXA2 тромбоцитарного происхождения активирует нейтрофилы, увеличивая экспрессию молекул межклеточной адгезии 1 (англ. intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1), их миграцию и экстравазацию [18].

Серотонин играет важную роль в адгезии нейтрофилов. Тромбоциты являются основным источником периферического серотонина [19]. В месте повреждения эндотелия тромбоциты покрывают большую площадь, мигрирующие нейтрофилы используют каркас тромбоцитов, чтобы прикрепиться и мигрировать к месту воспаления [20].

Было показано, что взаимодействие тромбоцитов и нейтрофилов привлекает к участку воспаления моноциты через CD40–CD40L зависимый механизм [21]. Тромбоциты привлекают моноциты также посредством гетеромеров тромбоцитарного происхождения CCL5 (англ. сhemokine (C-C motif) ligand 5; хемокина (С-С мотив) лиганд 5) и нейтрофильного происхождения HNP1 (англ. human neutrophil peptide 1; пептид нейтрофилов человека 1, альфа-дефензин) [22]. Кроме того, тромбоциты при активации высвобождают содержимое своих альфа-гранул, содержащих такие медиаторы как аденозиндифосфат (АДФ). Связывание АДФ с пуриновыми рецепторами P2Y [23] приводит к быстрой транслокации P-селектина к мембране, усиливающее привлечение нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к месту повреждения [24]. Высвобождаемый тромбоцитами белок HMGB1 (англ. high-mobility group protein B1; протеин В1 из группы высокомобильных белков) также участвует в привлечении иммунных клеток [25]. Недавние данные in vitro указывают на то, что и CXCL4, также известный как тромбоцитарный фактор 4 (англ. platelet factor 4, PF4) – важный хемокин, секретируемый активированными тромбоцитами, может участвовать в миграции моноцитов при связывании с рецептором CCR1 (англ. C-C chemokine receptor type 1; C-C-рецептор хемокина 1) [26].

Тромбоциты не только привлекают иммунные клетки к участку воспаления, но и активно сами перемещаются в направлении повреждения. Подвижные тромбоциты способны к активной адгезии к эндотелию при помощи АДФ и TXA2. Кроме того, тромбоциты захватывают инфекционные агенты и повышают активность фагоцитов [27]. Бактерии активируют тромбоциты, усиливая их взаимодействие с нейтрофилами, что приводит к усилению фагоцитоза [28]. На мышиных моделях было показано, что мыши с истощенным пулом тромбоцитов склонны к бактериемии, вызываемой Staphylococcus aureus [29]. Также оказалось, что активированные тромбином тромбоциты усиливают поглощение и уничтожение грамположительных бактерий дендритными клетками, макрофагами и нейтрофилами [30]. Тромбоциты могут образовывать агрегаты с эритроцитами, инфицированными малярийными плазмодиями, и уничтожать возбудителя [31].

Микровезикулы тромбоцитов играют важную роль в иммунных реакциях. Они содержат нуклеиновые кислоты, белки, липиды и другие молекулярные составляющие тромбоцитов и мегакариоцитов. Микровезикулы, содержащие микроРНК, могут модулировать транскрипцию мРНК в макрофагах, перепрограммируя их на фагоцитарный фенотип [32].

Тромбоциты и регуляция работы иммунных клеток / Platelets and regulation of immune cell functioning

Цитокины и хемокины являются основой образования, роста, дифференцировки и функционирования иммунных клеток. Адгезия моноцитов к тромбоцитам на фоне воспаления приводит к транслокации ядерного фактора каппа B (англ. nuclear factor kappa B, NF-κB) в ядро, где усиливается экспрессия CCL2 и интерлейкина-8 (англ. interleukin-8, IL-8) моноцитами. CCL5 тромбоцитов активирует высвобождение провоспалительных хемокинов моноцитов и Р-селектинзависимое взаимодействие [33]. Хемокин CXCL4 (англ. chemokine (C-X-C motif) ligand 4; хемокина (С-Х-С мотив) лиганд 4) играет важную роль в системном воспалительном ответе. На фоне воспаления тромбоциты высвобождают CXCL4 через Rac-1 (англ. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1; Ras-связанный С3 субстрат токсина ботулина) путь, привлекая нейтрофилы, повреждая ткани, повышая концентрации CCL5, CXCL1 и CXCL2. Подавление CXCL4 в эксперименте снижает концентрацию провоспалительных маркеров и улучшает общее состояние лабораторных животных [34]. Тромбоциты являются источниками CD40L (CD154), который оказывает выраженное влияние на лейкоциты. При системной красной волчанке (СКВ) было показано, что тромбоциты активируются иммунными комплексами, и затем образуют агрегаты с моноцитами и дентритными клетками. В результате увеличивается высвобождение интерферона альфа (англ. interferon alfa, IFN-α) последними через CD40/CD40L. Истощение пула тромбоцитов на мышиных моделях СКВ улучшало течение заболевания, трансфузия же их усугубляла его [35]. Взаимодействие нейтрофилов и тромбоцитов через CD40 регулируется по принципу положительной обратной связи, а именно, выделение супероксида и активных форм кислорода лейкоцитами повышается на фоне стимуляции секреции CD40L тромбоцитами [36].

Еще одним важным регуляторным цитокином является IL-1β. Лейкоциты являются основным источником этого цитокина в организме человека. Тромбоциты повышают экспрессию лейкоцитами данного цитокина, а экспрессия Р-селектина, как было показано, связана с более высокими концентрациями IL-1β и IL-6 после стимуляции ex vivo [37]. На фоне вирусной инфекции тромбоциты высвобождают микровезикулы, заполненные IL-1β, в результате активации NLRP3 (англ. NOD-, LRRand pyrin domain-containing protein 3; NOD-, LPR и пирин домен содержащий протеин 3) реактивными формами кислорода [38].

Помимо провоспалительного влияния тромбоцитов на клетки иммунитета, они также обладают и противовоспалительными эффектами за счет прямого взаимодействия или высвобождения различных факторов. В эксперименте было показано, что тромбоциты и их производные снижают концентрацию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor-α, TNF-α) и IL-6. Истощение пула тромбоцитов приводило к увеличению смертности и полиорганной недостаточности на мышиных моделях септического шока, и наоборот, введение тромбоцитов ослабляло генерализованный гипериммунный ответ [39]. В другом исследовании было показано, что добавление тромбоцитов в культуру мононуклеарных клеток приводило к подавлению продукции IL-6 и TNF-α и более высокой продукции IL-10 после стимуляции PAMPs различного происхождения [40].

Тромбоциты и внеклеточные ловушки нейтрофилов / Platelets and neutrophil extracellular traps

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (англ. neutrophil extracellular traps, NETs) представлены внеклеточной ДНК и цитоплазматическими и ядерными белками, выбрасываемыми нейтрофилами при активации во внеклеточное пространство [41]. После первоначального открытия этого процесса было показано, что тромбоциты играют фундаментальную роль в формировании этих структур при сепсисе путем изначального определения TLR4 лигандов и запуская адгезию нейтрофилов [42]. Позже стало известно, что этот механизм взаимодействия зависит от αLβ2-интегрина LFA-1 (англ. lymphocyte function-associated antigen 1; антиген-1, связанный с функцией лимфоцитов; CD11a/CD18) [43]. Микровезикулы тромбоцитов, богатые HMGB1, также стимулируют нейтрофилы к синтезу NETs [44]. Наряду с этим, взаимодействие тромбоцитарного гликопротеина Ib (англ. glycoprotein Ib, GPIb) с нейтрофильным CD18, высвобождение фактора фон Виллебранда (англ. von Willebrand factor, vWF) и CXCL4 способствуют нетозу (процессу формирования NETs нейтрофилами). При этом интенсивность нетоза зависит от продукции TXA2, и, соответственно, может подавляться под влиянием ацетилсалициловой кислоты и простациклина [45].

Тромбоциты и вирусы / Platelets and viruses

Противовирусный иммунитет традиционно связывают с работой лейкоцитов. Однако при различных вирусных инфекциях, включая вирус Денге [46], вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гриппа [47] и SARS-CoV-2 [48], отмечено повышение активности тромбоцитов. Основным противовирусным эффектом тромбоцитов является секвестрация вирусных частиц, что ограничивает распространение вируса. У пациентов с ВИЧ доказано, что тромбоциты связывают и эндоцитируют вирионы ВИЧ, способствуя выведению вирусных частиц из циркуляции [49]. Во время активации тромбоцитов α-гранулы доставляются на поверхность клетки и экстернализируются, таким образом высвобождая широкий спектр биоактивных молекул, включая PF4 (также называемый хемокин CXCL4). Помимо того, что он является важным агентом хемотаксиса лейкоцитов, PF4 обладает прямой противовирусной активностью [50]. Тромбоциты также выделяют противомикробные протеины, такие как PD1–PD4 (англ. programmed cell death proteins 1–4; белки запрограммированной клеточной смерти 1–4), которые обладают противовирусной активностью против вируса коровьей оспы [51]. Недавние исследования показали, что тромбоциты содержат вирусспецифический иммуноглобулин G (IgG), способный потенциально нейтрализовать in vitro и in vivo цитомегаловирус (ЦМВ) и вирус гриппа А [52]. IgG локализуется в α-гранулах [53]. Мегакариоциты способны поглощать IgG, где они хранятся в α-гранулах с последующей секрецией зрелыми тромбоцитами. При этом IgG, высвобождаемый из тромбоцитов, более эффективен в отношении нейтрализации вируса по сравнению с IgG плазмы [52].

Тромбоциты также способны управлять местным иммунным ответом на инфекцию. Цитомегаловирус распознается тромбоцитарным TLR2, что приводит к дегрануляции тромбоцитов, хемотаксису лейкоцитов и образованию агрегатов тромбоцитов с нейтрофилами, моноцитами, В-клетками, Т-клетками и дендритными клетками [54]. Благодаря этим взаимодействиям тромбоцитов и лейкоцитов, тромбоциты выставляют вирусные антигены лейкоцитам через главный комплекс гистосовместимости класса I [55], а также стимулирующие сигналы к антигенпрезентирующим клеткам [56]. Аналогичные реакции были отмечены при лихорадке Денге [57].

В ответ на противовирусный иммунитет тромбоцитов вирусы развили механизмы уклонения от распознавания тромбоцитов. Вирусы взаимодействуют с рецепторами тромбоцитов на их поверхности. Вирус Денге и ВИЧ связываются с поверхностными лектиновыми рецепторами и специфичными для дендритных клеток межклеточными молекулами адгезии-3захватывающими нонинтегринами (англ. dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN) на тромбоцитах [58]. Такие взаимодействия приводят к интернализации вирусных частиц, после чего такие вирусы как ВИЧ, ЦМВ и вирус гепатита С (ВГС) могут продолжать размножаться как внутри мегакариоцитов, так и в тромбоцитах [58]. Кроме использования тромбоцитов в качестве места репликации, некоторые вирусы используют циркулирующие тромбоциты в качестве клеточных носителей, чтобы избежать иммунного обнаружения. К таким вирусам относят вирус гриппа [59] и ВИЧ, которые по существу образуют латентные вирусные резервуары. Считается, что ВГС использует циркулирующие тромбоциты для транспорта в печень, где взаимодействия тромбоцитов и гепатоцитов продлевают длительность персистенции вируса [60].

Тромбоцитопения при вирусной инфекции / Thrombocytopenia in viral infection

Тромбоцитопения является общим признаком при тяжелом течении различных вирусных инфекций. Механизмы ее развития следующие:

1. нейраминидазная активность вируса гриппа и простого герпеса сокращает продолжительность жизни тромбоцитов, обеспечивая их быстрый клиренс в печени и селезенке [61];
2. активность нейраминидазы изменяет плоидность мегакариоцитов, морфологию и размер будущих тромбоцитов [62];
3. вирусы простого герпеса (ВПГ), влияя на активность тромбопоэтина, уменьшают формирование колонии мегакариоцитов [63], снижают их выживаемость и дифференцировку [64];
4. нарушение дифференцировки мегакариоцитов происходит и за счет изменения экспрессии цитокинов в костном мозге, в частности, при инфицировании вирусом Денге [65];
5. при инфицировании вирусом Денге, ВИЧ и другими вирусами отмечается нарушение развития мегакариоцитов, активации тромбоцитов, митохондриальная дисфункция, снижение клеточной целостности и усиление апоптоза [66][67].

Нарушения процессов агрегации и активации тромбоцитов при вирусной инфекции / Impaired platelet aggregation and activation in viral infection

Вирусная инфекция также оказывает влияние и на функцию тромбоцитов [68].

1. Вирус Коксаки В (CVB) связывается и проникает в тромбоциты благодаря Коксаки адренорецептору. CVB не может реплицироваться внутри тромбоцитов, зато он модулирует активность и усиливает высвобождение Р-селектина и эффекты фосфатидилсерина, что в совокупности способствуют взаимодействиям тромбоцитов с лейкоцитами, приводит к разрушению тромбоцитов и тромбоцитопении [69].
2. Вирус коровьей оспы также проникает в тромбоциты [68]. В исследованиях in vitro было продемонстрировано снижение агрегации тромбоцитов и усиление высвобождения ими серотонина после инфицирования. В исследованиях in vivo было показано, что заражение вирусом коровьей оспы приводит к усилению внутрисосудистого свертывания [70], связанного с усиленным ответом тромбоцитов. Это несоответствие может указывать на то, что вирус коровьей оспы может влиять на функцию эндотелия, что имеет решающее значение для регуляции функций тромбоцитов in vivo [71].
3. Повышенная активация тромбоцитов при инфицировании вирусами гриппа частично связана с высвобождением моноцитами цитокинов, которые далее активируют тромбоциты [72].
4. Иммунный ответ на инфицирование ВГС, ВИЧ, ЦМВ и короновирусами заключается в выработке нейтрализующих антител против вирусных гликопротеинов. Антитела к гликопротеинам перекрестно реагируют с интегринами тромбоцитов, приводя к развитию антителозависимой тромбоцитопении [73].
5. Повреждая эндотелий, вирусы косвенно влияют на функцию тромбоцитов. Например, вирус Денге поражает эндотелиальные клетки, способствуя активации эндотелия, эндотелиально-тромбоцитарных взаимодействий и повышая проницаемость сосудов [38][74]. Нарушение целостности сосудов у инфицированных вирусом способствует активации тромбоцитов и может представлять собой один из механизмов усиленного клиренса тромбоцитов.
6. При хронической вирусной инфекции, такой как ВИЧ, пациенты нуждаются в постоянном подавлении репликации вируса. Исследования показали, что некоторые антиретровирусные препараты повышают риск инфаркта миокарда [75] в связи с повышением активации и агрегации тромбоцитов [76]. Эти эффекты дополнительно усиливает влияние на эндотелий антиретровирусной терапии [77].

Таким образом, как сама вирусная инфекция, так и противовирусные препараты способны оказывать влияние на активацию тромбоцитов.

Тромбоциты и SARS-CoV-2 / Platelets and SARS-CoV-2

Параллельная активация воспаления и коагуляции в сочетании с привлечением и активацией большого количества иммунных клеток в участки инфицирования получила название «иммунотромбоз» и была впервые описана B. Engelmann и S. Massberg в 2013 г. [78].

COVID-19 – это вирусная инфекция с полиморфной клинической картиной, которую определяет амплитуда иммунотромбоза и степень повреждения тканей. Исследования показывают, что коагулопатия при COVID-19 представляет собой сочетание локального потребления тромбоцитов в легких, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) и тромботической микроангиопатии.

Тяжелое воспаление легких, обструктивный микрососудистый иммунотромбоз легких пациентов с COVID-19 приводят к легочному тромбозу/тромбоэмболии, лежащим в основе полиорганной недостаточности и смертности [79].

Информационная РНК SARS-CoV-2 обнаруживается в тромбоцитах пациентов с COVID-19 [80]. До конца не ясно, проникает ли SARS-CoV-2 в тромбоциты посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. SARS-CoV-2 проникает в клетки хозяина путем связывания с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (англ. angiotensin converting enzyme 2, ACE2) [81]. Некоторые исследования показали, что ни ACE2, ни белок не обнаружены в тромбоцитах [82]. В других исследованиях сообщается об экспрессии ACE2 в тромбоцитах, которая способствует прямой активации тромбоцитов SARS-CoV-2 [83]. Причина этого несоответствия, возможно, связана с различиями в приготовлении отмытых тромбоцитов или генетическими различиями между популяциями.

Активация тромбоцитов является одним из звеньев патофизиологии COVID-19. У пациентов с COVID-19 отмечают аномальную морфологию тромбоцитов, с наличием крупных, гиперхромных и вакуолизированных тромбоцитов [84]. В исследовании было показало, что у пациентов с COVID-19 активность тромбоцитов повышена по сравнению с контрольными группами [85]. Более высокие концентрации тромбоцитарно-моноцитарных и тромбоцитарно-гранулоцитарных агрегатов, свидетельствующие о повышенной системной активации тромбоцитов, наблюдаются у пациентов с COVID-19-ассоциированной пневмонией [86]. Тромбоциты в условиях COVID-19 способствуют росту концентрации фибриногена, фактора фон Виллебранда и фактора XII, что в результате способствует усилению XII-зависимой коагуляции [86]. Тромбоциты пациентов с тяжелой формой COVID-19 вызывают экспрессию тканевого фактора in vivo [66].

Особый интерес представляют различные циркулирующие биомаркеры, такие как фибрин/фибриноген, D-димер, P-селектин, мультимеры фактора фон Виллебранда, растворимый тромбомодулин и тканевой фактор. Основой активности их как биомаркеров являются их рецепторы и сигнальные пути на эндотелиальных клетках, тромбоцитах, моноцитах и эритроцитах. Остается открытым вопрос о том, непосредственно ли на систему гемостаза действует вирус или гемостатическая активация является вторичной по отношению к воспалительному ответу.

В настоящее время нет единого мнения в отношении экспрессии ACE2 на тромбоцитах. Связывается ли SARS-CoV-2 с тромбоцитами напрямую через ACE2 или существуют альтернативные пути? Исследования в этом направлении могут открыть механизмы гиперкоагуляции при цитокиновом шторме. Борьба с цитокиновым штормом при тяжелом течении COVID-19 может включать в том числе и антитромбоцитарную терапию [87]. Было показано, что при приеме ацетилсалициловой кислоты снижалась необходимость в искусственной вентиляции легких, частота госпитализа-ции в реанимационное отделение и внутрибольничная смертность у госпитализированных с COVID-19 пациентов [88]. Более глубокое понимание вклада тромбоцитов в противовирусный иммунитет повысит эффективность терапии вирусных инфекций (рис. 1).

Заключение / Conclusion

Ранее известные как звенья системы гемостаза, тромбоциты приобрели иное значение в последние годы благодаря результатам исследований, которые поместили их в один ряд с важнейшими игроками иммунного ответа.

Тромбоциты являются участниками противоинфекционного иммунитета, патогенеза аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний. Растущий интерес к тромбоцитам связан еще и с тем, что они могут явиться новой мишенью для разработки противовоспалительной терапии с многообещающими результатами.