Антропометрические характеристики плода являются важным показателем исхода беременности и напрямую зависят от нормального процесса плацентации [1]. Нарушение развития плаценты будет приводить к плацентарной недостаточности и развитию задержки роста плода (ЗРП) и преэклампсии [2–4]. ЗРП возникает, когда плод не достигает своего внутриутробного потенциала роста в результате нарушения функции плаценты, при этом его размер < 10-го процентиля для данного срока гестации [1]. ЗРП является распространенным осложнением беременности, частота которого достигает 10 % во всем мире [5]. ЗРП является основной причиной мертворождений и неонатальной заболеваемости и смертности [5], а долгосрочные последствия ЗРП во взрослом возрасте связаны с повышенным риском развития сердечно-сосудистых и метаболических нарушений [6].

Патогенез ЗРП сложен и может быть обусловлен различными факторами (материнскими, плацентарными, внутриутробными) [7], вызывающими эндотелиальную дисфункцию, окислительный стресс и, как следствие, возникновение плацентарной недостаточности, приводящей к нарушению снабжения плода питательными веществами и/или кислородом [8].

Важную роль в развитии плода и плаценты играет метаболизм фолиевой кислоты, так как она необходима для осуществления процессов метилирования, связанного с биосинтезом ДНК, РНК, регуляцией экспрессии генов для обеспечения роста, пролиферации и дифференцировки клеток [9]. Дефицит фолиевой кислоты и возникающая в результате этого гипергомоцистеинемия способствуют усилению апоптоза в плаценте и снижению секреции хорионического гонадотропина человека, что может привести к развитию плацентарной недостаточности и ЗРП [10–12].

Недавние молекулярно-генетические исследования показали, что полиморфизмы генов, связанные с ферментами фолатного цикла и цикла метионина, могут быть ассоциированы с ЗРП и/или низкой массой тела новорожденного [13–16], при этом в других работах такие ассоциации выявлены не были [17][18]. Неоднозначность результатов молекулярно-генетических исследований роли полиморфизма генов фолатного цикла и цикла метионина в формировании массы тела новорожденного диктует необходимость дальнейшего проведения таких работ.

Цель: изучение взаимосвязи полиморфизма генов метаболизма фолиевой кислоты и метионина с массой тела новорожденных у беременных с ЗРП в популяции Центрально-Черноземного региона России.

В ретроспективное исследование были включены 98 беременных с синдромом ЗРП, проходившие обследование в Перинатальном центре ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» в период с 2008 по 2015 гг.

Критерии включения: возраст 16 лет и более; место рождения и проживания – Центрально-Черноземный регион России; русская национальность; одноплодная беременность (24–41-я неделя беременности), закончившаяся живорождением; подписанное информированное согласие.

Критерии исключения: возраст менее 16 лет; многоплодная беременность; роды на сроке до 24-й недели беременности; врожденные пороки развития плода/новорожденного, врожденные аномалии матки; отказ от участия в исследовании.

Диагностика задержки роста плода / Diagnostics of fetal growth retardation

Диагностику ЗРП проводили на основании ультразвуковой фетометрии на аппарате XARIO SSA-660A (Toshiba Medical Systems Corporation, Япония), определяли окружность живота плода, окружность головы, бипариетальный диаметр и длину бедренной плечевой кости. Предполагаемая масса тела плода была рассчитана с использованием формулы Hadlock [19]. ЗРП определяли как массу плода < 10-го процентиля средней массы нормального плода того же гестационного возраста.

Методы молекулярно-генетического тестирования / Мolecular genetic analysis

Для молекулярно-генетического тестирования было отобрано 5 полиморфных локусов генов метаболизма фолиевой кислоты и метионина: rs699517 TYMS, rs2790 TYMS, rs1979277 SHMT1, rs1805087 MTR, rs1801394 MTRR. Эти локусы являются функционально значимыми, так как связаны с эпигенетическими изменениями и транскрипцией в соответствующих генах (данные получены in silico с помощью онлайн ресурса Haploreg v4.2, Broad Institute Inc., США).

Для выделения ДНК из лейкоцитов венозной крови использовали фенол-хлороформную экстракцию. Для обнаружения отобранных полиморфных маркеров в ДНК-образцах использовали ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR) на основе TaqMan зондов.

Методы генетико-статистического анализа / Methods of genetic-statistical analysis

Ассоциации между однонуклеотидными полиморфными локусами (англ. single nucleotide polymorphism, SNP) организма матери и массой тела новорожденного оценивали методом лог-линейного регрессионного анализа (использовали пакет программ gPLink) [20]. Так как распределение массы тела новорожденного не было нормальным (критерий Шапиро–Уилка), использовали его трансформированные значения. Направленность ассоциативной связи оценивали при помощи регрессионного коэффициента (β) и его ошибки (SE) (изменение трансформированного показателя массы тела новорожденного на минорный аллель). Для оценки индивидуальных эффектов SNP тестировались аллельная, аддитивная, доминантная и рецессивная генетические модели с коррекцией на ковариаты – возраст, индекс массы тела (ИМТ) до беременности и множественные сравнения (использовали адаптивные пермутационные процедуры с расчетом показателя pperm). В конечном итоге, показатель pperm < 0,0125 принимали за статистически значимый.

Функциональные эффекты однонуклеотидных полиморфных локусов, показавших значимые ассоциации с массой тела новорожденного, оценивали с помощью различных биоинформационных ресурсов: PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) – связь с несинонимическими заменами, HaploReg v4.2 (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) – эпигенетические эффекты, GTEx Рortal (https://www.gtexportal.org/home/) – экспрессия и альтернативный сплайсинг генов. Оценка статистической значимости полученных данных проводиласьс использованием показателя частоты ложных обнаружений (англ. false discovery rate, FDR). В работу включали данные с уровнем значимости pFDR ≤ 0,05.

Исследование проведено в соответствии с этическими стандартами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и ее последующими изменениями. Все пациентки подписали информированное согласие на включение в исследование и использование полученных результатов для публикаций в научных изданиях в обезличенном виде. Комитет по этике медицинского института НИУ БелГУ одобрил дизайн этого исследования, протокол № 2 от 13.02.2008.

Установлены ассоциации rs1801394 MTRR с массой тела новорожденного у женщин с ЗРП в рамках рецессивной модели (табл. 1). Выявлено, что минорный аллель А rs1801394 MTRR статистически значимо связан с более низкой массой тела новорожденного (β = –0,34 ± 0,13; p = 0,009).

С использованием онлайн портала PolyPhen-2 установлено, что полиморфизм rs1801394 гена MTRR определяет миссенс-замену оснований аденина на гуанин в положении 66 гена, приводящую к изменению аминокислоты изолейцина на метионин в 22 положении фермента метионин-синтаза-редуктазы. Предикторный класс данной мутации определяется как «probably damaging» («вероятно повреждающий») (оценка риска = 1,00; чувствительность = 0,00; специфичность = 1,00).

По данным онлайн ресурса HaploReg v4.2, rs1801394 MTRR характеризуется выраженным регуляторным потенциалом. Данный полиморфный маркер расположен в сайте модификации гистонов в промоторных областях и облястях энхансеров в различных тканях и органах взрослого организма и плода (14–18 тканей). При этом обращает внимание, что полиморфизм rs1801394 MTRR локализован в сайте модификации гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в тканях и органах взрослого организма и плода, патогенетически связанных с массой тела и ростом новорожденного, а именно: культивируемые клетки мезодермы, энтодермы, эктодермы; головной мозг, в том числе мозг плода (гиппокамп, черная субстанция, кора и другие отделы); жировые ядра; скелетные мышцы, в том числе мышцы плода; амнион (только энхансеры); первичные клетки остеобластов и др.

Также rs1801394 MTRR локализован в области сайта связывания с двумя факторами транскрипции: STAT (англ. signal transducer and activator of transcription 3; сигнальный белок и активатор транскрипции 3) и TBX5 (T-box 5). Различия между оценками логарифмов шансов (англ. logarithm of the odds, LOD scores) аллельных вариантов A и G для STAT составляют –1,0, а для фактора TBX5 – –12,0. Таким образом, аллель А rs1801394 MTRR, связанный с более низкой массой тела новорожденного, понижает аффинность к данным транскрипционным факторам.

С помощью онлайн-ресурса GTEx Portal установлено, что rs1801394 MTRR ассоциирован с уровнем экспрессии гена MTRR в различных органах и тканях, патогенетически связанных с массой тела и ростом новорожденного: подкожная и висцеральная жировая ткань (β = –0,16; р = 2,2×10–8; pFDR ≤ 0,05 и β = –0,19; р = 6,6×10–12; pFDR ≤ 0,05, соответственно); щитовидная железа (β = –0,13; р = 2,6×10–5; pFDR ≤ 0,05); культура клеток фибробластов (β = –0,11; р = 1,5×10–6; pFDR ≤ 0,05); различные отделы головного мозга – гипоталамус, гиппокамп, мозжечок, базальные ганглии, кора и др. (β от –0,40 до –0,56; р от 1,8×10–11 до 2,7×10–17; pFDR ≤ 0,05).

В итоге, rs1801394 MTRR, ассоциированный с массой тела новорожденного, обладает важными функциональными эффектами. Он определяет аминокислотную замену в метионин-синтаза-редуктазе (Ile22Met), локализован в регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в культуре клеток эктодермы, энтодермы и мезодермы; первичных клетках остеобластов; головном мозге; жировых ядрах; скелетных мышцах и др.; определяет чувствительность ДНК к двум факторам транскрипции (STAT и TBX5), связан с уровнем экспрессии мРНК гена MTRR в подкожной и висцеральной жировой ткани, щитовидной железе, культуре клеток фиб-робластов, различных отделах головного мозга.

Согласно информации из базы данных GeneCards (The Weizmann Institute of Science, Израиль, https://www.genecards.org), ген MTRR кодирует фермент метионин-синтаза-редуктазу, участвующую в биохимическом цикле преобразования метионина, который, в свою очередь, сопряжен с циклом фолиевой кислоты. Фолатный цикл связан с каскадом превращений фолиевой кислоты в тетрагидрофолаты, являющиеся донорами метильных групп, используемых в процессах биосинтеза пуринов, превращения уридинмонофосфата в тимидилат [9].

Цикл преобразования метионина связан с образованием S-аденозилметионина – основного донора метила для дальнейшего его использования метилтрансферазами в реакциях метилирования РНК, ДНК, гистонов [9]. Метилирование важно для многих клеточных процессов, включая межбелковые взаимодействия и эпигенетическую регуляцию, которые играют важную роль в эмбриональном развитии [12]. Промежуточным продуктом этих реакций метилирования является гомоцистеин, который посредством фермента метионинсинтазы преобразуется снова в метионин с использованием тетрагидрофолата в качестве донора метила и витамина B12 (кобаламина) в качестве кофактора [10]. Однако кобаламин может окисляться, что приводит к инактивации метионинсинтазы. MTRR катализирует восстановительное метилирование кобаламина с использованием S-аденозилметионина в качестве донора метила. Таким образом, MTRR играет главную роль в поддержании метионинсинтазы в активной форме и, следовательно, может быть важным фактором, определяющим концентрацию гомоцистеина в плазме крови [21].

В ряде исследований на разных популяциях подтвердилась связь высоких плазменных концентраций гомоцистеина с повышенным риском развития ЗРП или рождения ребенка с меньшей массой тела в разные триместры беременности [10–12][22]. При этом результаты других работ не продемонстрировали наличие каких-либо различий в уровнях гомоцистеина у беременных с ЗРП [23][24].

Также стоит отметить и неоднозначность результатов исследования связи полиморфизма rs1801394 MTRR с концентрацией гомоцистеина в плазме крови [25–27]. В работе, проведенной на китайской популяции, установили, что генотип GG полиморфизма rs1801394 MTRR связан с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме крови [26]. Напротив, в раннем исследовании D.J. Gaughan с соавт. на выборке из Северной Ирландии было выявлено, что генотип AA rs1801394 MTRR способствует умеренному увеличению концентрации гомоцистеина в плазме крови [25]. Наконец, в работе, проведенной на популяции Китая, не обнаружены ассоциации данного полиморфизма с уровнем гомоцистеина в плазме крови [27].

Обращает на себя внимание неоднозначность и противоречивость результатов исследования связи rs1801394 MTRR с риском развития различных заболеваний, таких как дефекты нервной трубки [28], дефект межжелудочковой перегородки [29], рак молочной железы [26], колоректальный рак [21] и др.

Разнонаправленность ассоциаций rs1801394 MTRR с уровнем гомоцистеина в плазме крови, риском различных заболеваний может быть обусловлена различиями в частоте встречаемости данного полиморфизма в разных этнических группах по всему миру [30].

Таким образом, аллель А полиморфизма rs1801394 гена MTRR является фактором риска более низкой массы тела веса новорожденного. Данный полиморфный локус обладает важными функциональными эффектами. Он определяет аминокислотную замену в метионин-синтаза-редуктазе (Ile22Met), находится в регионе модифицированных гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в жировых ядрах, скелетных мышцах, первичных клетках остеобластов, культуре клеток эктодермы, энтодермы и мезодермы, головном мозге и др., определяет чувствительность ДНК к двум факторам транскрипции (STAT и TBX5), связан с уровнем экспрессии мРНК гена MTRR в подкожной и висцеральной жировой ткани, щитовидной железе, культуре клеток фибробластов, различных отделах головного мозга.