Согласно данным Международного агентства по изучению рака (англ. International Agency for Research on Cancer, IARC), в мире ежегодно регистрируется более 2 млн новых случаев рака молочной железы (РМЖ), и у 685 тысяч женщин РМЖ является причиной смерти [1][2]. По оценкам экспертов ВОЗ, к 2040 г. ежегодное количество женщин с впервые выявленным РМЖ в мире возрастет до более чем 3 млн человек (прирост составит 39 %), а ежегодное число женщин, умерших от РМЖ, увеличится до 1 млн (прирост составит 49 %) [3]. Не меньшие темпы прироста заболеваемости/смертности РМЖ к 2040 г. прогнозируются и для Российской Федерации (РФ): ежегодное количество впервые заболевших возрастет на 37 % и достигнет уровня более 100 тыс., а число умерших от РМЖ увеличится на 49 % и составит около 35 тыс. человек [3].

Рак молочной железы имеет «выраженную» наследственную природу [4–10]. Во-первых, согласно данным близнецовых исследований, выполненных в европейских популяциях и включающих материалы о нескольких десятках [4] и сотнях [5] тысяч пар близнецов, вклад генетических факторов в развитие РМЖ составляет 31 %. Во-вторых, свыше 25 % наследственных случаев заболевания обусловлены мутациями в высоко пенетрантных (BRCA1, BRCA2, PTEN, TP53, CDH1, STK11) генах, которые повышают риск развития РМЖ до 80 %, и 2–3 % – в умеренно пенетрантных (CHEK2, BRIP1, ATM, PALB2) генах, которые обусловливают двукратное увеличение риска возникновения РМЖ [6]. В-третьих, результаты проведенных масштабных полногеномных исследований (англ. genome-wide association study, GWAS) показали ассоциации с заболеванием свыше 220 полиморфных локусов многочисленных генов-кандидатов [8][9], и эти GWAS однонуклеотидных полиморфизмов (англ. single nucleotide polymorphism, SNP) «объясняют» 18 % наследуемости РМЖ. Однако при этом лишь у 30–40 % заболевших РМЖ имеется отягощенный семейный анамнез, и лишь 5 % случаев болезни связаны с мутациями в высоко и умеренно пенетрантных генах [10], а GWAS локусы «описывают» лишь около 44 % предполагаемых генетических детерминант РМЖ (18 % из 41 %) [8], что указывает на наличие проблемы «скрытой» наследственности при РМЖ и определяет актуальность дальнейших генетических исследований заболевания.

Рак молочной железы является гормонозависимым заболеванием, в патофизиологию которого широко вовлечены половые гормоны (эстрогены, тестостерон и др.) [11–13]. Считается, что более высокий уровень половых гормонов повышает риск развития РМЖ, однако эти взаимосвязи (наличие/направленность) зависят от пре- и постменопаузального статуса, индекса массы тела (ИМТ) женщины, рецепторного статуса опухоли и др. [11][13]. В регуляцию концентрации биодоступных тестостерона и эстрадиола вовлечен глобулин, связывающий половые гормоны (англ. sex hormone-binding globulin, SHBG), высокий уровень которого в организме приводит к снижению содержания свободных («активных») половых гормонов, что имеет важное значение для патофизиологии РМЖ [14, 15].

Значимым фактором риска развития РМЖ у постменопаузальных женщин является ожирение за счет более высокой продукции эстрогенов из андрогенов в жировой ткани [16–18]. При этом уровень SHBG и SHBG-связанных половых гормонов (андрогены и эстрогены) в значительной степени коррелирует с ИМТ: половые гормоны имеют положительные корреляции с ИМТ, а SHBG – отрицательные [19][20]. Таким образом, можно предположить, что ИМТ, являясь значимым модификатором уровня SHBG и связанных с ним половых гормонов в организме, может оказывать и значимое влияние на характер связи генов-кандидатов SHBG с РМЖ. В рамках данной гипотезы выполнено настоящее исследование.

Цель: оценить роль полиморфных вариантов rs4149056 SLCO1B1, rs8023580 NR2F2 и rs7910927 JMJD1C при развитии РМЖ у женщин в зависимости от наличия/отсутствия ожирения.

Проведен ретроспективный сравнительный анализ генетических характеристик (частот аллелей, генотипов и комбинаций генотипов) больных РМЖ и контрольной группы. ОГБУЗ «Белгородский областной онкологический диспансер» в течение 2010–2016 гг. послужил клинической базой, на которой формировалась выборка больных (n = 358). ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» в этот же период времени являлась базой (в ходе проводимой диспансеризации населения) для формирования группы контроля (n = 1140). Верификация диагноза РМЖ основывалась на данных иммуногистохимического лабораторного исследования (проводилось сертифицированными врачами-патологоанатомами в ОГБУЗ «Белгородское патологоанатомическое бюро») опухолевого материала, полученного в ходе проведения оперативного вмешательства по поводу данного заболевания [21].

Критерии включения для группы с РМЖ: гистологически подтвержденный диагноз «карцинома молочной железы»; впервые выявленное заболевание; принадлежность к русской национальности; проживание/рождение участника исследования в населенных пунктах Центрально-Черноземного региона РФ [22].

Критерии исключения для группы с РМЖ: иные разновидности злокачественных образований молочной железы; принадлежность к иной (не русской) национальности; проживание/рождение участника исследования вне населенных пунктов Центрально-Черноземного региона РФ; близкая степень (1–2 степень) родства между участниками исследования.

Критерии включения для группы контроля: женский пол; принадлежность к русской национальности; проживание/рождение участника исследования в населенных пунктах Центрально-Черноземного региона РФ.

Критерии исключения для группы контроля: наличие злокачественных и тяжелых соматических заболеваний; принадлежность к иной (не русской) национальности; проживание/рождение участника исследования вне населенных пунктов Центрально-Черноземного региона РФ; близкая степень (1–2 степень) родства между участниками исследования.

Общий объём изученной выборки составил 1498 женщин (358 больных РМЖ и 1140 контроля), которые в зависимости от наличия/отсутствия ожирения были разделены на 2 группы: с ожирением (119 больныхРМЖ и 253 контроля) и без ожирения (239 больных РМЖ и 887 контроля). Для определения наличия ожирения у каждой женщины был рассчитан ИМТ как отношение массы тела к росту (кг/м2). Значение ИМТ > 30 свидетельствовало о наличии ожирения. Показатели ИМТ в изучаемых группах были следующие: больные РМЖ с ожирением – 34,95 ± 4,76 и группа контроля с ожирением – 33,66 ± 4,12 (р = 0,007); больные РМЖ без ожирения – 27,55 ± 2,85 и группа контроля без ожирения – 26,54 ± 2,71 (р = 0,01). Детальная характеристика изучаемых групп женщин приведена в ранее опубликованной работе N. Pavlova с соавт. [23].

При планировании/проведении данного исследования было получено одобрение этического комитета медицинского института НИУ БелГУ (протокол № 4 от 11.04.2012) и учитывались стандарты, изложенные в Надлежащей клинической практике (англ. Good Clinical Practice, GCP) и Хельсинской декларации. Каждая обследуемая подтвердила согласие (подписано собственноручно) на участие в настоящей работе.

Методы лабораторного генетического исследования / Methods for laboratory genetic study

Проведено генотипирование трех SNP – rs7910927 JMJD1C, rs8023580 NR2F2, rs4149056 SLCO1B1, связь которых с концентрацией SHBG показана в ранее выполненных GWAS [24–27]. Для генотипирования SNP применяли амплификаторы CFX96 и комплекты реагентов, специально разработанных «Тест-Ген» (Тест-Ген, Россия) для данного исследования, использовали метод TaqMan-зондов и методики, приведенные ранее [28].

Выполнен анализ ассоциаций rs7910927 JMJD1C, rs8023580 NR2F2, rs4149056 SLCO1B1 и их взаимодействий с РМЖ отдельно в каждой изученной группе женщин – с ожирением и без ожирения. Перед процедурой анализа ассоциаций все локусы прошли проверку на соответствие их распределения закономерности Харди–Вайнберга; при показателе pХарди-Вайнберг > 0,05 локус использовали далее в генетических расчетах [29]. При оценке ассоциаций использовали 2 подхода: 1) были рассмотрены ассоциации каждого изученного SNP с заболеванием, вычисляли отношение шансов (ОШ) и его 95 % доверительный интервал (95 % ДИ) [30] в различных генетических моделях (в расчетах использовали программное обеспечение gPLINK (https://zzz.bwh.harvard.edu/plink/gplink.shtml) [31]); 2) выполнено в программе MB-MDR (англ. Model Based Multifactor Dimensionality Reduction) одноименным методом анализа [32] моделирование потенциально значимых для РМЖ межлокусных комбинаций генотипов, а также смоделированы конкретные комбинации генотипов, имеющие рисковое или протективное влияние на риск возникновения заболевания. Как при оценке самостоятельных генетических эффектов рассматриваемых локусов, так и при анализе их взаимодействия между собой проводилась коррекция на конфаундер (возраст) и множественные сравнения – выполнялись пермутационные процедуры с расчетом pperm [33]. В качестве «приемлемого» уровня статистической значимости выявляемых отличий в генетических характеристиках между больными и контролем была принята величина pperm ≤ 0,05.

Полученные данные о распределении генотипов/аллелей rs7910927 JMJD1C, rs8023580 NR2F2, rs4149056 SLCO1B1 в группах больных/контроля с ожирением/без ожирения представлены в таблице 1. Материалы таблицы позволяет заключить, что, во-первых, соотношение между наблюдаемым/ожидаемым распределением полиморфизмов во всех 4 рассмотренных подгруппах не имеет статистически значимых различий (pХарди-Вайнберг > 0,05), и поэтому полученные экспериментальные данные не имеют никаких ограничений для использования в генетико-статистических расчетах при оценке риска РМЖ. Во-вторых, все 3 рассмотренных полиморфизма (rs7910927 JMJD1C, rs8023580 NR2F2, rs4149056 SLCO1B1) не оказывают самостоятельного статистически значимого влияния на риск развития РМЖ ни в одной из 4 проанализированных генетических моделях (pperm > 0,05).

Проведенное методом MB-MDR (в одноименной программе) моделирование межлокусных взаимодействий, связанных с РМЖ, показало статистически достоверные взаимодействия рассматриваемых 3 полиморфизмов (rs8023580–rs4149056–rs7910927) как в подгруппе женщин с ожирением (р = 0,013; pperm = 0,047), так и в подгруппе индивидов без ожирения (р = 0,0002; pperm = 0,0012). Статистические показатели трехлокусной модели (rs8023580–rs4149056–rs7910927), ассоциированной с риском РМЖ, у женщин с ожирением были следующие: коэффициент регрессии (β) и показатель Вальда (англ. Wald statistic) для комбинаций генотипов рисковой направленности – 1,42 и 3,99 соответственно, для комбинаций генотипов протективной направленности – β = –2,45, Wald statistic = 5,09; у женщин без ожирения: для комбинаций генотипов рисковой направленности – β = 1,03, Wald statistic = 14,07, для комбинаций генотипов протективной направленности – β = –0,62, Wald statistic = 5,63. Вышеприведенные данные указывают на то, что данная трехлокусная комбинация, во-первых, имеет наиболее выраженный фенотипический эффект протективной направленности среди женщин с ожирением, о чем свидетельствует наиболее высокое значение β = –2,45 в этой подгруппе; во-вторых, наиболее существенное статистически подтвержденное влияние (характеризуется максимальными значениями Wald statistic = 14,07) эта комбинация демонстрирует среди женщин без ожирения (рисковый эффект).

Среди женщин с ожирением были смоделированы 2 трехлокусные комбинации генотипов, ассоциированные с РМЖ, одна протективной направленности (ТС rs8023580 – ТТ rs4149056 – GG rs7910927; β = –2,45; p = 0,024), другая – рисковой направленности (ТС rs8023580 – ТС rs4149056 – GG rs7910927; β = 1,42; p = 0,046). Следует отметить, что эти 2 комбинации генотипов (протективная/рисковая) отличаются между собой только по генотипу локуса rs4149056: в протективной комбинации присутствует генотип ТТ этого SNP (β = –2,45), в рисковой – генотип ТС (β = 1,42). Таким образом появление в трехлокусной комбинации генотипов лишь одного аллеля С rs4149056 существенно видоизменяет конечный фенотипических эффект данной комбинации генотипов: она из протективной становится рисковой для развития РМЖ.

У женщин без ожирения статистически значимыми для риска РМЖ оказались 3 комбинации генотипов: одна протективная (ТС rs8023580 – ТТ rs4149056 – GТ rs7910927; β = –0,47; p = 0,049), 2 другие – рисковые (ТС rs8023580 – ТС rs4149056 – GТ rs7910927; β = 0,91; p = 0,004 и ТС rs8023580 – СС rs4149056 – GТ rs7910927; β = 1,45; p = 0,048). Обращает на себя внимание наличие у женщин без ожирения такой же закономерности по фенотипическому эффекту генотипов локуса rs4149056, как и у женщин с ожирением, только еще более выраженной. Так, у женщин без ожирения, не имеющих в генотипе аллеля С rs4149056 (генотип ТТ), вышеуказанная трехлокусная комбинация генотипов является протективной по отношению к РМЖ (β = –0,47); при появлении в генотипе одного аллеля С rs4149056 (генотип ТС) трехлокусная комбинация становится фактором риска развития РМЖ (β = 0,91), и максимальный рисковый эффект (β = 1,45) данная трехлокусная комбинация демонстрирует при наличии у женщины в генотипе двух аллелей С rs4149056 (генотип СС).

Итак, на основе вышеприведенных данных можно сделать заключение, что полиморфизм rs4149056 при межлокусных взаимодействиях генов SLCO1B1, NR2F2 и JMJD1C является «универсальным» генетическим фактором, определяющим риск развития РМЖ как у женщин с ожирением, так и без ожирения: появление в генотипе женщины аллеля С rs4149056 приводит к повышению риска возникновения заболевания.

Следует отметить одну особенность межлокусных взаимодействий, отличающих между собой подгрупп женщин с ожирением и без ожирения: у женщин с ожирением РМЖ-значимым генотипом, входящим в состав трехлокусной комбинации, связанной с риском развития заболевания, является генотип GG rs7910927, а у женщин без ожирения РМЖ-значимым является генотип GТ rs7910927.

Установленное в нашем исследовании «ключевое» универсальное значение rs4149056 SLCO1B1 в формировании подверженности к РМЖ в межгенных взаимодействиях как у женщин с ожирением, так и у женщин без ожирения согласуется с литературными материалами, посвященными медико-биологическому значению данного локуса. В каталоге GWAS мы обнаружили 172 различных исследования, в которых подтверждена «архиважная» роль этого полиморфизма в организме: выявлено 187 GWAS-значимых ассоциаций этого полиморфизма с 91 различным биологическим путем, в том числе уровень половых гормонов (эстрон; общий и свободный тестостерон; SHBG), гормоны щитовидной железы (тироксин), триглицериды, билирубин, различные метаболиты сыворотки крови (X-12063, X-12456, X-11529, X-11538, X-13429 и др.) и др. [34]. При этом минорный аллель С rs4149056 SLCO1B1 ассоциирован с более высоким уровнем общего и биодоступного тестостерона, низкой концентрацией SHBG у женщин как пре-, так и постменопаузального возраста [25][27], а частый аллель Т этого полиморфизма связан, наоборот, с более низким содержанием общего и биодоступного тестостерона, высоким уровнем SHBG у женщин [26]. Согласно GWAS данных A.D. Coviello с соавт., генетический вариант Т rs4149056 SLCO1B1 маркирует повышенную концентрацию SHBG в суммарной выборке женщин и мужчин (β = 0,029; p = 2×10–8) [24]. Весьма важно, что аллель С rs4149056 SLCO1B1 показал GWAS-значимые ассоциации с повышенным уровнем конъюгатов эстрона в плазме крови у пациенток с ER (рецепторы эстрогенов; англ. estrogen receptors)-позитивным РМЖ, прооперированных на ранней стадии заболевания (β = 0,5; р = 4×10–11) [35].

Итак, аллельный вариант С rs4149056 SLCO1B1, связанный с более высоким уровнем эстрона, общего и биодоступного тестостерона, низкой концентрацией SHBG у женщин (данные ранее выполненных GWAS [24][25][27][35]), при наличии его в генотипе женщины (и повышении его «дозы») в рамках трехлокусных взаимодействий (rs8023580–rs4149056–rs7910927) повышает риск развития РМЖ (данные настоящего исследования), что полностью корреспондируется с современными данными о роли половых гормонов в патофизиологии данной опухоли: повышенные концентрации эстрогенов/тестостерона и сниженный уровень SHBG являются фактором риска возникновения РМЖ [11–15]. Эти представления нашли подтверждения и в широкомасштабных генетико-статистических исследованиях (выполнялась менделевская рандомизация GWAS данных), показывающих генетические связи между тестостероном и РМЖ (прямая направленность связи) [12], SHBG и РМЖ (обратная направленность связи) [13, 36]. Причем, согласно нашим результатам, свои однонаправленные фенотипические эффекты в организме (рисковые по отношению к РМЖ) аллель С rs4149056 SLCO1B1 проявляет как у женщин с ожирением, так и у женщин без ожирения.

Полиморфизм rs4149056 (521T>C) SLCO1B1 является миссенс-мутацией и приводит к аминокислотной замене Val174Ala в четвертом трансмембранном сегменте белка SLCO1B1 [37]. Протеин SLCO1B1 (переносчик органических анионов, член семейства 1B1 переносчиков растворенных веществ; англ. solute carrier organic anion transporter family member 1B1) кодируется геном SLCO1B1, синтезируется преимущественно в печени и является транспортером для многочисленных эндогенных соединений (конъюгаты эстронов и др.) из системного кровообращения в гепатоциты [35]. При этом показано, что аллель С rs4149056 связан со снижением мембранной экспрессии транспортера SLCO1B1 и, таким образом, со снижением транспортной активности этого белка, что является причиной увеличения концентрации в плазме его субстратов (эстрогенов и др.), и это приводит к их более выраженному фенотипическому проявлению [35].

В нашем исследовании выявлены особенности межлокусных взаимодействий (rs8023580–rs4149056–rs7910927) у женщин с ожирением и без: у женщин с ожирением РМЖ-значимым генотипом, входящим в состав трехлокусной комбинации, связанной с рис-ком развития заболевания, является генотип GG rs7910927, а у женщин без ожирения РМЖ-значимым является генотип GТ rs7910927. Согласно ранее полученным GWAS данным, аллель Т rs7910927 связан с низким уровнем SHBG в организме (β = –0,048; p = 6×10–35) [24]. Таким образом, у женщин с ожирением (является существенным фактором риска РМЖ [17][18][38], в том числе в изученной нами выборке больных преимущественно потсменопаузального периода (ОШ = 1,46; p = 0,01) [23], и приводит к значительному снижению SHBG [38]) РМЖ-значимые эффекты межлокусных взаимодействий (rs8023580–rs4149056–rs7910927) проявляются без SHBG-понижающего аллеля Т rs7910927, тогда как у женщин без ожирения (отсутствует этот значимый фактор риска развития заболевания) для проявления РМЖ-значимых эффектов вышеуказанного межлокусного взаимодействия необходимо наличие в генотипе женщины SHBG-понижающего аллеля Т rs7910927. Эти данные могут свидетельствовать о модифицирующем влиянии ожирения на характер межлокусных взаимодействий SHBG-значимых генов – SLCO1B1, NR2F2 и JMJD1C, определяющих подверженность к РМЖ.

Связь ИМТ (характеризует содержание жировой ткани в организме) с риском РМЖ известна уже давно [16–18][38][39]. При этом считается, что высокий ИМТ имеет рисковое значение для РМЖ у женщин в постменопаузе (за счет более высокой продукции эстрогенов из андрогенов под действием повышенной активности ароматазы, связанной со значительным содержанием жира в организме; повышенной продукции провоспалительных цитокинов; развития гиперинсулинемии и инсулинорезистности, приводящих к гиперпродукции инсулиноподобных факторов роста [16–18]) и протективное влияние у женщин в пременопаузе (за счет низких концентраций прогестерона и эстрогенов при более длительном ановуляторном цикле вследствие высокого содержания жира) [38][39].

Согласно данным литературы, у постменопаузальных женщин уровень SHBG и SHBG-связанных половых гормонов (андрогены и эстрогены) в значительной степени коррелирует с ИМТ [19][20]. В многочисленных клинико-экспериментальных исследованиях убедительно показано, что у женщин в постменопаузе ИМТ/ожирение положительно связаны как с эстрогенами, так и с андрогенами (в том числе свободными) и отрицательно – с SHBG [40–42]. Интересно, что значительное снижение массы тела у постменопаузальных женщин приводило к существенному уменьшению содержания эстрогенов (эстрон, эстрадиол), свободного эстрадиола, свободного тестостерона и увеличению уровня циркулирующего SHBG [20], в то время как увеличение ИМТ у женщин этой возрастной когорты обусловливало выраженное повышение концентраций эстрона (на 21–34 %), эстрадиола (на 45–68 %), свободного эстрадиола (на 101 %), свободного тестостерона (на 35 %) и снижение уровня SHBG (на 29–35 %) [19], и данные изменения в концентрациях SHBG и SHBG-связанных половых гормонов имеют первостепенное значение для риска РМЖ у постменопаузальных женщин (пониженный и повышенный риск, соответственно) [43]. Методом менделевской рандомизации показаны «причинные» отрицательные связи между повышенным ИМТ и низким уровнем SHBG (–0,45 стандартного отклонения SHBG на 1,00 стандартного отклонения ИМТ) [44].

В ряде ранее выполненных исследований изучены взаимосвязи ИМТ, полиморфизмов SHBG и РМЖ [45, 46]. Интересные данные о модифицирующем влиянии ИМТ на связь полиморфизма SHBG с РМЖ получены в работе Cui Y. с соавт. [45]. Авторы показали, что SNP rs6259 (Asp327Asn) SHBG имел наиболее выраженные ассоциации с РМЖ у женщин с низким ИМТ (OШ = 0,46), а также у индивидуумов ER-позитивной формой заболевания (OШ = 0,64), тогда как у пациенток с ER-негативным заболеванием данный полиморфизм не был связан с риском РМЖ [45]. Также в работе продемонстрировано существенное влияние rs6259 на уровень SHBG у здоровых женщин постменопаузального возраста, особенно с низким ИМТ: концентрация SHBG у индивидуумов, имеющих в генотипе аллель Asn, на 10 % превышала аналогичный показатель женщин, не имеющих этого аллеля (в генотипе содержалось 2 аллеля Asp), и при этом у женщин с низким ИМТ эти различия в содержании SHBG составляли 20 % [45]. «Защитный» эффект rs6259 (Asp327Asn) в азиатской популяции показан и в работе В. Zhang с соавт. (анализировалась выборка из 1144 больных и 1256 контроля, Shanghai Breast Cancer Study), причем наиболее выраженные ассоциации этого SNP с РМЖ были зарегистрированы у худощавых (ИМТ < 23) женщин в постменопаузе [46].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что полиморфизм rs4149056 при межлокусных взаимодействиях генов SLCO1B1, NR2F2 и JMJD1C является «универсальным» генетическим фактором, определяющим риск развития РМЖ как у женщин с ожирением, так и без ожирения: появление в генотипе женщины аллеля С rs4149056 приводит к повышению риска возникновения заболевания. Генотип GG rs7910927 является РМЖ-значимым в межлокусных взаимодействиях у женщин с ожирением, а у женщин без ожирения таковым является генотип GТ rs7910927.