Рак молочной железы (РМЖ) представляет собой наиболее распространенную злокачественную опухоль у женского населения, происходящую из эпителия молочной железы [1][2]. Согласно статистическим материалам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), РМЖ является наиболее частым раком – в 2020 г. в мире на учете состояло 7,8 млн женщин, у которых за последние 5 лет было диагностировано данное заболевание, и число утраченных лет здоровой жизни (англ. disability-adjusted life years, DALYs) у женщин с этим диагнозом в мире превышает аналогичный показатель в отношении любого другого вида рака [3]. В Российской Федерации (РФ) в 2021 г. РМЖ занимал первое место в структуре онкологической патологии у женского населения (22,1 %), причем максимального значения данный показатель достигал среди женщин в возрасте 30–59 лет (29,0 %) [1]. За 10-летний период (2011–2021 гг.) абсолютное число впервые в жизни установленных диагнозов РМЖ у женщин в России выросло в 1,21 раза – с 57534 случаев в 2011 г. до 69714 случаев в 2021 г. [1].

Результаты детального анализа этиопатогенетических механизмов возникновения РМЖ, полученные различными научными коллективами, указывают на вовлеченность наследственных факторов в возникновение заболевания: считается, что в 30 % генетические влияния в той или иной мере определяют риск развития РМЖ [4–8]. Показано, что ряд случаев заболевания (примерно у каждой двадцатой женщины) являются результатом мутаций в группе так называемых высоко- и среднепенетрантных генов (BRCA1, BRCA2, PALB2, CHEK2 и др.), наличие которых в организме женщины существенно повышает риск появления РМЖ [8][9]. Данные многочисленных полногеномных исследований (англ. genome-wide association study, GWAS), направленных на поиск генетических причин РМЖ, позволяют говорить о более 200 конкретных генетических детерминантах, связанных с риском возникновения заболевания (объясняют не более 18 % наследственности РМЖ) [6][7], которые могут зависеть от молекулярно-биологического подтипа опухоли, связанного с «особенностями» ее рецепторного статуса [10]. Однако, несмотря на вышеприведенные факты, существенная доля генетических детерминант РМЖ (не менее 40 %) на сегодняшний период времени остается «скрытой» и непонятной (так называемая «недостающая» наследственность), что диктует важность и актуальность продолжения исследовательских работ по данной тематике.

Среди основных механизмов патогенеза РМЖ, детально описанных в литературе, роль половых гормонов, как факторов риска заболевания, является неоспоримой [11–13]. Указывается на наличие прямых корреляций между содержанием таких половых гормонов, как эстрогены и тестостерон, и высокими рисками возникновения РМЖ, однако данные связи могут зависеть от молекулярно-биологического подтипа опухоли (чувствительность рецепторов к эстрогенам и прогестерону) [11–13]. Значимым фактором, модулирующим активность половых гормонов, является глобулин, связывающий половые гормоны (англ. sex hormone-binding globulin, SHBG), который, связываясь с тестостероном и эстрогенами, в значительной степени регулирует содержание их свободных (т. е. биологически активных) форм в организме, и эти процессы имеют важную роль в патофизиологии РМЖ [11][12][14][15]. Таким образом, генетические детерминанты, «контролирующие» содержание SHBG в организме, могут являться значимыми генетическими факторами риска развития РМЖ, что показано в ряде работ [16–18]; однако в других работах таких связей выявлено не было [19–21]. Имеющаяся неоднозначность по этому вопросу, а также отсутствие данных работ в российских популяциях определили актуальность настоящего генетического исследования.

Цель: установить особенности ассоциаций полиморфизма генов, связанных с уровнем SHBG, с РМЖ различных молекулярно-биологических подтипов.

Исследование основано на ретроспективном сравнительном изучении генетических характеристик больных РМЖ (изучены пациентки с люминальными А/В и тройным негативным подтипом опухоли) и контрольной группы.

Критерии включения: карцинома молочной железы, выявленная впервые и имеющая люминальные А/В или тройной негативный молекулярно-биологические подтипы; самоидентифицированная русская национальность; место рождения и проживание на территории Центрально-Черноземного региона РФ [22][23].

Критерии исключения: иные молекулярно-биологические подтипы (не люминальные А/В или тройной негативный) и морфологические формы заболевания (не карцинома); иная, чем русская национальность; место рождения или проживания за пределами Центрально-Черноземного региона РФ; близкие родственные связи.

Выборка больных РМЖ для настоящего исследования включала 261 женщину – пациентки с люминальными А/В (n = 153) и тройным негативным (n = 108) молекулярно-биологическими подтипами и формировалась в течение 2010–2016 гг. в профильных отделениях ОГБУЗ «Белгородский областной онкологический диспансер». Объединение люминального А и люминального В подтипов в одну подгруппу (люминальные A/В) было выполнено с целью повышения репрезентативности данной подгруппы за счет увеличения ее численности и повышения вследствие этого мощности проводимого ассоциативного анализа. Группа сравнения (контрольная группа) для двух вышеуказанных подгрупп больных (люминальные А/В и тройной негативный молекулярно-биологические подтипы) была одинакова и включала 1140 женщин.

Диагноз заболевания и его молекулярно-биологический подтип верифицировались на основе результатов иммуногистохимического изучения образцов опухоли [24] (проводилось в профильном иммуногистохимическом отделении ОГБУЗ «Белгородское патологоанатомическое бюро»), взятых на исследование при проведении оперативного вмешательства (интраоперационно). Контрольная группа включала женщин без клинико-анамнестических данных о наличии РМЖ и была сформирована по результатам плановых ежегодных профилактических осмотров (диспансеризации), проводимых в перинатальном центре ОГБУЗ «Белгородская ОКБ Святителя Иоасафа»; у каждой женщины с ее информированного согласия производился отбор венозной крови в специальные пробирки – вакутейнеры, как для общего и биохимического (содержание глюкозы и др.) анализа (согласно стандартам диспансеризации), так и для последующего получения (выделения) ДНК (использовались вакутейнеры с ЭДТА).

Настоящее исследование выполнялось в соответствии со стандартами Надлежащей клинической практики (англ. good clinical practice, GCP) и принципами Хельсинской декларации при подписанном согласии на участие в исследовании каждой участницей. Протокол исследования № 4 от 11.04.2012 был одобрен этическим комитетом медицинского института НИУ БелГУ.

Выполнено генотипирование образцов ДНК пациенток с РМЖ (n = 261) и женщин контрольной группы (n = 1401). Для экспериментального исследования отобрано 4 однонуклеотидных полиморфных локуса (англ. single nucleotide polymorphism, SNP), показавших связь с концентрацией циркулирующего SHBG в организме в ранее проведенных GWAS [25–27]: rs12150660 SHBG, rs10454142 PPP1R21, rs780093 GCKR, rs17496332 PRMT6. Генотипирование проводилось на амплификаторе CFX96 с использованием наборов реагентов, предназначенных для детекции методом TaqMan зондов и разработанных ООО «Тест-Ген» (Ульяновск, Россия) по методике, изложенной ранее [28].

С целью оценки «качества» проведенного генотипирования было проведено сопоставление показателей наблюдаемого и ожидаемого распределения генотипов при выполнении равновесия закона Харди–Вайнберга по всем 4 изучаемым локусам отдельно в двух подгруппах больных и в контроле [29]. Ассоциации SNP SHBG-связанных генов с РМЖ разных молекулярно-биологических подтипов выявлялись методом логистической регрессии [30] с расчетом таких показателей ассоциации, как отношение шансов (ОШ) и 95 % доверительный интервал ОШ (95 % ДИ) при коррекции на конфаундер (возраст) [31] и учете рисков ложноположительных результатов (для снижения их вероятности использовалось пермутационное тестирование с вычислением pperm [32]). Для всех локусов были проведены вычисления в рамках 4 «общепринятых» в генетических исследования моделей ассоциативных связей: аллельная, рецессивная, доминантная, аддитивная; расчеты выполнялись в специализированной программе gPLINK [33], и статистически значимыми считались результаты, соответствующие pperm ≤ 0,05 [31]. На завершающем этапе работы была проведена комплексная оценка функционального значения РМЖ-ассоциированного SHBG-значимого локуса на основе современных биоинформатических ресурсов QTLbase [34] и HaploReg [35].

При изучении распределения генотипов полиморфных локусов rs12150660 SHBG, rs10454142 PPP1R21, rs780093 GCKR, rs17496332 PRMT6 в рассматриваемых двух подгруппах больных РМЖ и в контроле на предмет сопоставления показателей наблюдаемого и ожидаемого их распределения при выполнении равновесия закона Харди–Вайнберга не выявлено статистически значимых отклонений среди больных с РМЖ люминальными А/В подтипами и в контроле: значения «р» для всех локусов превышали пороговый уровень p ≤ 0,05 (табл. 1). У пациенток с РМЖ тройного негативного подтипа показатель значимости для локуса rs10454142 PPP1R21 составил р = 0,027, и при введении соответствующей поправки Бонферрони, учитывающей число изучаемых локусов (n = 4), данные различия оказались статистически незначимыми – p(bonf) ≥ 0,0125 (0,05/4). Эти данные позволяют говорить о «достаточном» для проведения последующего ассоциативного анализа качестве проведенного экспериментального генетического исследования.

Выполненный анализ ассоциаций SNP SHBG-значимых генов с РМЖ разных молекулярно-биологических подтипов показал наличие значимых ассоциаций с риском РМЖ у пациенток с люминальнымм А/В подтипами и отсутствие статистически достоверных связей изучаемых локусов с заболеванием у больных с тройным негативным подтипом (табл. 2). В группе больных с люминальными А/В подтипами с риском РМЖ был ассоциирован полиморфный локус rs10454142 PPP1R21. Генотип СС данного полиморфизма являлся фактором риска развития РМЖ люминальных А/В подтипов согласно рецессивной генетической модели (СС vs. TС+TT). Наличие у женщины генотипа СС rs10454142 PPP1R21 более чем в 2 раза повышало риск возникновения РМЖ люминальных А/В подтипов (ОШ = 2,07; 95 % ДИ = 1,14–3,77; p = 0,017; pperm = 0,018) (табл. 2).

Материалы базы HaploReg указывают на функциональную значимость rs10454142 PPP1R21 в гепатоцитах – данный SNP локализуется в функционально «значимых» участках генома, таких как энхансеры и активные энхансеры (маркируются фракциями гистоновых белков H3K4me1 и H3K27ac соответственно, в области которых находится рассматриваемый нами локус), промоторы и активные промоторы (маркируются фракциями гистоновых белков H3K4me3 и H3K9ac соответственно). Наряду с этим, согласно данным базы QTLbase, rs10454142 PPP1R21 оказывает влияние на уровень метилирования ряда участков генома [cg15846641 (chr2:48541264)] в печени (карцинома печени). Следует отметить, что печень является основным местом продукции SHBG в организме, и вышеуказанные in silico данные дают основание предполагать, что за счет своих существенных эпигенетических эффектов в гепатоцитах rs10454142 PPP1R21 может влиять на уровень экспрессии генов, контролирующих синтез SHBG.

Аллельный вариант С rs10454142 PPP1R21, который в соответствии с результатами данной работы более чем в 2 раза повышает риск развития РМЖ люминальных А/В подтипов (OШ = 2,07), согласно GWAS материалов A.D. Coviello с соавт., связан с низкой концентрацией циркулирующего SHBG [25]. На основе метода менделевской рандомизации N.L. Dimou с соавт. была выявлена генетическая связь между высоким уровнем SHBG и низким риском РМЖ в целом (OШ = 0,94) и ER (рецепторы эстрогенов; англ. estrogen receptors)-позитивного варианта опухоли (OШ = 0,92), но высоким риском ER-негативной формы заболевания (OШ = 1,09) у постменопаузальных женщин [16]. С использованием метода менделевской рандомизации в работе F. Chen с соавт. показаны обратные генетические связи между уровнем SHBG и ER-позитивным РМЖ, но прямые корреляции между SHBG и ER-негативным РМЖ [14]. Следует отметить, что РМЖ люминальных А/В подтипов является ER-позитивным [24], и таким образом, установленные в нашей работе ассоциации SHBG-понижающего аллельного варианта С rs10454142 PPP1R21 с повышенным риском РМЖ люминальных А/В подтипов согласуются в полной мере с вышеприведенными литературными материалами по этому вопросу.

SHBG является гликопротеином (90–100 кДа), состоящим из двух одинаковых пептидных цепей, каждая из которых содержит стероид-связывающие сайты [36]. SHBG продуцируется в основном в печени (гепатоцитами) (важные регуляторные эффекты rs10454142 PPP1R21 обнаружены нами при in silico исследовании в печени), однако имеются данные о его образовании в молочной железе, головном мозге, матке, яичниках, плаценте и других органах [37]. Показано, что гормоны щитовидной железы, эстрогены повышают выработку SHBG, а провоспалительные цитокины, наоборот, снижают образование SHBG (за счет регуляции экспрессии ядерного фактора гепатоцитов 4-альфа) [36]. Благодаря наличию стероид-связывающих сайтов, SHBG связывает и транспортирует тестостерон, эстрадиол и другие половые стероиды в плазме, влияя таким образом на их биодоступность [37]. Между концентрацией циркулирующего SHBG и содержанием биодоступных (активных) тестостерона и эстрогенов в организме женщины имеются обратные корреляции [37].

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о важной патогенетической роли SHBG при РМЖ [11][12][14–16][38][39]. Убедительно показано, что повышенное содержание циркулирующего SHBG имеет протективное значение для развития заболевания, однако данные взаимосвязи (их наличие и направленность) могут зависеть от пре- и постменопаузального статуса женщин, молекулярного подтипа опухоли [11][12][14–16]. Так, в метаанализе, выполненном A.E. Drummond с соавт., показана дозозависимая ассоциация высоких уровней SHBG с низким риском развития РМЖ у постменопаузальных женщин (OШ = 0,54) и отсутствие значимых взаимосвязей у пременопаузальных женщин (OШ = 0,96; p > 0,05) и в группах больных с разным ER статусом (позитивным/негативным) [15]. Аналогичные данные получены и в работе R.S. Arthur с соавт. для протоковой карциномы in situ: уровень SHBG имел обратные взаимосвязи с риском заболевания у постменопаузальных женщин (ОШ = 0,75) и не был ассоциирован с болезнью в группе пременопаузальных женщин [12]. Несколько иные результаты получены в исследовании S.T. Tin с соавт., в котором установлено однонаправленное влияние SHBG (протективное значение повышенного уровня этого белка при РМЖ) как у пременопаузальных (ОШ = 0,96), так и постменопаузальных (OШ = 0,89) женщин [11]. В работе F. Chen с соавт. показаны обратные ассоциации SHBG с ER-позитивной опухолью (OШ = 0,83) и прямые ассоциации с ER-негативной (OШ = 1,12) и тройной негативной (ОШ = 1,19) опухолями [14]. Аналогично, N.L. Dimou с соавт. продемонстрировали протективное значение высокого содержания SHBG при РМЖ в целом (OШ = 0,94) и при ER-позитивной опухоли (OШ = 0,92) и рисковое значение при ER-негативном раке (OШ = 1,09) [16].

В основе корреляции SHBG с риском РМЖ могут лежать следующие механизмы. Во-первых, SHBG имеет первостепенное значение в регуляции уровня биодоступных (активных) тестостерона и эстрогенов в женском организме [36–38] и за счет этого (модуляция фенотипических эффектов тестостерона и эстрогенов) может быть вовлечен в патофизиологию РМЖ [15][38][39]. Причем высокое содержание циркулирующего SHBG будет обусловливать его «максимальное» связывание с тестостероном и эстрогенами и приводить к низким уровням биодоступных (активных) половых гормонов в организме женщины, что в конечном итоге проявится в минимально выраженных фенотипических эффектах тестостерона и эстрогенов [37].

Во-вторых, SHBG самостоятельно может потенцировать различные внутриклеточные эффекты (увеличение внутриклеточного цАМФ, активация протеинкиназы A, ингибирование MAP-киназных путей и др.) за счет связывания со специфическими, высокоаффинными мембранными рецепторами в различных тканях человека (гипоталамус, эндометрий, плацента и др.) [39]. Важно, что только SHBG, не связанный с половыми гормонами, может взаимодействовать с мембранными рецепторами, и при этом если половые стероиды изначально связываются с SHBG, то они предотвращают его взаимодействие с клеточными рецепторами и соответственно блокируют его внутриклеточные эффекты [39]. Имеются экспериментальные данные о взаимодействии «SHBG-мембраны» в эстрогензависимых клетках РМЖ линии MCF-7 [39]. Конечным результатом внутриклеточных эффектов SHBG является снижение пролиферативной активности клеток и индукция апоптоза, что имеет протективное значение при развитии РМЖ [38].

В-третьих, SHBG может ингибировать действие эстрогенов в клетках РМЖ [39]. Этот эффект может достигаться двумя путями: а) считается, что после связывания с мембранным рецептором SHBG может опять связывать стероиды с таким же сродством, как и в растворе [39]. Таким образом, дополнительный «антиэстрогеновый» эффект SHBG будет проявляться при соблюдении «правильной» последовательности его связывания – вначале с мембраной клеток (приводит к реализации каскада внутриклеточных антипролиферативных профессов), а затем со свободными стероидами, что будет приводить к уменьшению количества их биодоступных форм и соответственно к менее выраженным их самостоятельным фенотипическим эффектам в организме (снижение риска РМЖ); б) SHBG может модулировать активность эстрогензависимых генов в организме, участвующих в процессах роста и апоптоза клеток, приводя таким образом к ингибированию генов, подавляющих апоптоз (bcl-2, c-myc, EGF-R, PR и др.), обусловливая, в конечном итоге, восстановление апоптоза в клетках РМЖ [39]. Таким образом, в конечном итоге действие SHBG направлено на ингибирование эстрогенопосредованной клеточной пролиферации и анти-апоптоза.

Материалы, полученные в ранее проведенных работах по поиску ассоциаций SHBG-значимых SNP с РМЖ, неоднозначны. В результате исследования, проведенного Y. Cui с соавт. на выборке из 1106 больных РМЖ и 1180 контроля (шанхайская популяция Китая), показана связь функционально значимого полиморфизма SHBG (Asp327Asn) с заболеванием у постменопаузальных женщин (OШ = 0,73) (у пременопаузальных женщин ассоциаций выявлено не было) с наиболее выраженными эффектами у индивидуумов с низкой массой тела (OШ = 0,46) и пациенток с ER-позитивной опухолью (OШ = 0,64) (у больных с ER-негативной опухолью ассоциаций выявлено не было) [17]. Авторы показали, что у постменопаузальных женщин контрольной группы, имеющих аллельный вариант Asn, содержание SHBG в крови было на 10 % выше, чем у женщин без данного аллеля, а у постменопаузальных женщин с низкой массой тела различия в концентрации SHBG достигали 20 % [17]. Материалы, полученные D.J. Thompson с соавт., показали связь 10 SNP, расположенных в области гена SHBG (вблизи/внутри гена), с уровнем данного белка (изучено 1134 здоровых постменопаузальных женщин), но при этом лишь один из этих локусов (rs6257) был ассоциирован с РМЖ (изучена выборка из 6622 больных и 6784 контроля) [18]. A.M.vDunning с соавт. не выявили ассоциаций с РМЖ двух полиморфизмов, связанных с уровнем SHBG (5'UTR регион – определяет 2,4 % дисперсии SHBG и D356N – определяет 0,6 % дисперсии SHBG) у постменопаузальных женщин Великобритании (Anglian Breast Cancer Study) [19]. Также не обнаружено ассоциаций полиморфных вариантов гена SHBG с РМЖ среди женщин США (Северная Каролина) – изучены 1972 больных и 1776 контроля [20] и Китая (Чжэцзян) – рассмотрен rs6259 у 336 больных и 390 контроля [21].

Полученные в работе результаты дают основание полагать, что локус rs10454142 PPP1R21 (после проведения дополнительных клинико-генетических исследований в других популяциях России для подтверждения (репликации) выявленных закономерностей) может являться одним из перспективных генетических маркеров для использования в клинической практике для «выделения» среди клинически здоровых женщин группы риска по развитию РМЖ люминальных А/В подтипов и последующей реализации в этой группе женщин комплекса мероприятий, направленных как на профилактику возникновения РМЖ («устранение» средовых факторов риска развития заболевания), так и на его раннюю диагностику и своевременное проведение лечения на ранних стадиях заболевания.

Результаты проведенного генетического анализа показали, что полиморфный вариант rs10454142 PPP1R21 ассоциирован с риском развития РМЖ люминальных А/В подтипов и не связан с возникновением заболевания тройного негативного подтипа. Наличие у женщины генотипа СС rs10454142 PPP1R21 более чем в 2 раза повышало риск возникновения РМЖ люминальных А/В подтипов. Данный SNP локализуется в функционально «значимых» участках генома (энхансеры/активные энхансеры, промоторы/активные промоторы) и влияет на уровень метилирования ряда участков ДНК [ cg15846641 (chr2:48541264)] в гепатоцитах.