Венозный тромбоз и злокачественный процесс неразделимы. Тромбоз у онкологических пациентов является важным предиктором плохого прогноза. Венозная тромбоэмболия (ВТЭ) развивается примерно у 8 % пациентов со злокачественными новообразованиями [1]. На риск тромботических осложнений при раке оказывают влияние различные факторы, в частности, источник опухоли, например, колоректальный рак имеет больший риск тромбоза, чем другие опухоли [2].

Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) характеризуется повышением концентрации гомоцистеина (ГЦ) в плазме крови, которая в плазме крови здоровых людей составляет 5–15 мкмоль/л; при ГГЦ она может достигать 500 мкмоль/л. Значение ГГЦ доказано в патогенезе нейродегенеративных (деменция, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера) и сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета [3][4], мегалобластной анемии, арахнодактилии [5] и др.

Многочисленные исследования проведены и ведутся в настоящее время для подтверждения связи между ГГЦ и раком. И тому есть ряд предпосылок. Во-первых, у онкологических пациентов наблюдается более высокий уровень ГЦ в плазме крови при ВТЭ, которая является второй по частоте причиной смерти. Во-вторых, некоторые полиморфизмы генов ферментов – участников путей детоксикации ГЦ (транссульфирование и реметилирование) чаще встречаются при определенных опухолях [6]. ГЦ также был предложен в качестве потенциального биомаркера опухолевого роста для различных видов рака [7].

Цель: оценка вклада ГГЦ в развитие тромботических осложнений у пациенток со злокачественными новообразованиями женских половых органов и молочной железы.

Дизайн исследования / Study design

Проведено ретроспективное исследование архивного материала – результатов обследования 608 пациенток с новообразованиями женских половых органов и молочных желез I–IV стадий, госпитализированных с 2016 по 2020 гг. в ГБУЗ ГКОБ № 1 ДЗМ. Во время госпитализации у пациенток проводили отбор проб крови для определения маркеров наследственной и приобретенной тромбофилии, оценки состояния системы гемостаза, уровня ГЦ; все данные были внесены в общую базу. Для проведения данного исследования использованы данные из базы, а также данные амбулаторных карт пациенток в течение 1 года после выписки из стационара. Контрольная группа была сформирована из условно здоровых сотрудниц базы проводимого исследования.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения: возраст 18 и старше; диагноз онкологического заболевания (злокачественные новообразования яичников, шейки матки, тела матки и молочных желез I–IV стадий) по данным медицинской документации; наличие информации о состоянии здоровья в течение 1 года после выписки из стационара по данным амбулаторной карты.

Критерии включения (контрольная группа): возраст 18 и старше; отсутствие тромбозов и тромбоэмболий, онкологических, хронических воспалительных заболеваний в анамнезе.

Критерии исключения: возраст до 18 лет; активный инфекционный и/или воспалительный процесс на момент обследования по данным медицинской документации; декомпенсированный сахарный диа- бет; тяжелые сердечно-сосудистые заболевания; обострение хронических заболеваний почек и печени; наличие других сопутствующих онкологических заболеваний; тромбоцитопатии и коагулопатии; тромбоэмболические осложнения и прием антикоагулянтов и антиагрегантов; тромботический или геморрагический синдром; отсутствие данных о здоровье в течение 1 года после выписки из стационара в амбулаторной карте.

Группы обследованных / Patients groups

В исследование вошли 236 пациенток: 63 с опухолями яичников (группа 1), 51 с раком шейки матки (группа 2), 64 с опухолями молочных желез (группа 3), 58 со злокачественными новообразованиями тела матки (группа 4). Контрольную группу составили 50 женщин (рис. 1).

Методы исследования / Study methods

Оценивали следующие характеристики: возраст, индекс массы тела (ИМТ), источник опухоли, стадия заболевания на момент отбора крови, подтвержденный факт развития тромботического осложнения в динамике в течение 1 года.

Были проанализированы следующие лабораторные показатели: концентрация ГЦ плазмы крови, наличие или отсутствие полиморфизмов генов ферментов фолатного цикла – полиморфизмы С677Т и A1298C гена метилентетрагидрофолатредуктазы (англ. methy-lenetetrahydrofolatereductase, MTHFR), полиморфизм A2756G гена 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин метилтрансферазы (англ. 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase, MTR) и полиморфизм A66G гена 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин метилредуктазы (англ. 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase, MTRR).

Отбор проб крови / Blood sampling

При поступлении в стационар однократно у всех пациенток путем венепункции получали образцы плазмы, которые хранились после центрифугирования при температуре –80° С. Отбор крови натощак проводился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пробирку с 3,8 % раствором трехзамещенного цитрата натрия в соотношении 9:1. У женщин контрольной группы образцы плазмы отбирали однократно при проведении профилактического ежегодного осмотра.

Оценка содержания гомоцистеина / Assessing homocysteine level

Определение общего L-гомоцистеина в плазме крови проводили с помощью набора Axis® Homocysteine Enzyme Immunoassay (TECAN, Швейцария) методом конкурентного иммуноферментного анализа. Нормальное содержание ГЦ в плазме крови (у мужчин и женщин) составляет 5–15 мкмоль/л. Легкой степенью ГГЦ принято считать уровень ГЦ в 15–30 мкмоль/л, средней степенью – 31–100 мкмоль/л, тяжелой – более 100 мкмоль/л. В исследовании границей между группами был выбран показатель 22 мкмоль/л (среднее значение диапазона легкой степени ГГЦ).

Оценка полиморфизмов генов фолатного цикла / Assessing of folate cycle gene polymorphisms

В выделенной ДНК из плазмы крови обследованных участниц с помощью набора праймеров и рес- триктаз производства ООО «Центр молекулярной генетики» (Россия) амплифицированы полиморфные локусы методом полимеразной цепной реакции, далее проведен с помощью специфических эндонуклеаз рестрикционный анализ с использованием стандартного оборудования молекулярно-биологической лаборатории для проведения полимеразной цепной реакции. Продукты амплификации и рестрикции проанализированы путем электрофореза в 3 %-м агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Оценена частота следующих полиморфизмов фолатного цикла: MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR A66G, MTR A2756G.

Этические аспекты / Ethical aspects

Все процедуры, выполненные в данном исследовании, соответствовали этическим стандартам Хельсинской декларации 1964 г., ее последующим изменениям и сопоставимым нормам этики. В связи с ретроспективным характером исследования в его рамках оценивались обезличенные данные участниц исследования.

Статистический анализ / Statistical analysis

Для проведения статистического анализа использовано программное обеспечение Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., США). Анализ проводился с приведением среднеквадратического отклонения (SD), средней арифметической (M), минимальных и максимальных значений показателей. Нормальность распределения изучена с помощью теста Харке–Бера (Jarque–Bera test). Нулевая гипотеза H0 (остатки значений показателей групп имеют нормальное распределение) при значении p ≤ 0,05 была отклонена. Сравнение значений показателей между группами и непараметрическая оценка проведены с применением критерия Манна–Уитни для несвязанных выборок (Mann–Whitney U-test). За нулевую гипотезу H0 принято отсутствие различий между группами. H0 отклонялась при значениях p≤ 0,05. Модель логистической регрессии использовалась для оценки отношения шансов (ОШ; англ. odds ratio, ОR) и 95 % доверительного интервала (ДИ; англ. confidence interval, CI) концентрации ГЦ у онкогинекологических пациенток с тромбоэмболическими осложнениями и без них.

Средний возраст онкогинекологических пациенток (65,39 ± 11,55 лет) значимо не отличался (р = 0,045) от среднего возраста женщин контрольной группы (51,28 ± 9,41 год). Частота тромботических осложнений в течение 1 года после выписки из стационара составила 15,3 % (36/236), при этом у 30,5 % женщин концентрация ГЦ в плазме крови составила ≥ 22 мкмоль/л (72/236). Характеристика пациенток представлена в таблице 1.

Как показал логистический регрессионный анализ (табл. 2), по сравнению с пациентками с содержанием ГЦ < 22 мкмоль/л риск ВТЭ был в 2,99 раз выше у пациенток с концентрацией ГЦ в плазме крови ≥ 22 мкмоль/л (95 % ДИ = 1,1–8,08).

Достоверных различий в частоте полиморфизмов генов ферментов фолатного цикла в группах онкогинекологических пациенток и контрольной группе выявлено не было (р > 0,05) (табл. 3).

При этом у онкогинекологических пациенток с выявленными полиморфизмами генов ферментов фолатного цикла средние значения ГЦ в плазме крови оказались значимо выше (р < 0,05), чем у женщин контрольной группы с полиморфизмами (табл. 4).

Метаболизм гомоцистеина / Нomocysteine metabolism

Гомоцистеин представляет собой серосодержащую аминокислоту в составе фолатного цикла [8] (рис. 2). Находится ГЦ на путях взаимопревращения цистеина и метионина. Обмен ГЦ происходит двумя путями: через транссульфатирование и реметилирование [9]. При избытке метионина преобладает транссульфатирование, при котором с помощью фермента цистатион-β-синтазы (англ. cystathion-β-synthase, CBS) и пиридоксаль-5'-фосфата в качестве кофактора идет превращение ГЦ в цистатионин [10] (рис. 2). При низкой концентрации метионина ГЦ через бетаин- или фолат-зависимые реакции реметилируется в метионин. Фермент бетаин-гомоцистеин-S-метилтрансфераза (англ. betaine homocysteine-S-methyltransferase, BHMT) в бетаин-зависимом пути [11] катализирует включение метильной группы из бетаина в ГЦ с формированием метионина. В фолат-зависимом пути ГЦ с помощью MTR, также известной как метионинсинтаза, которая работает совместно с кофактором – витамином B12, получает метильную группу из N-5-метилтетрагидрофолата. Реакции с участием данного фермента запускают рециркуляцию тетрагидрофолата (из N-5-метилтетрагидрофолата), который далее может быть использован для синтеза нуклеотидов [12]. Тем самым фермент метионинсинтаза связывает пути обмена ГЦ и фолиевой кислоты (рис. 2). Синтез тетрагидрофолата зависит от присутствия экзогенных фолатов, и низкая концентрация фолиевой кислоты затрудняет реметилирование, что ведет к росту концентрации ГЦ в плазме крови.

Дефицит кобаламина и витамина B6, фолиевой кислоты [13], прием лекарственных средств, в частности противосудорожных препаратов [14], могут приводить к росту концентрации ГЦ в плазме. Способствуют росту концентрации ГЦ за счет снижения концентрации фолиевой кислоты и препараты таких групп, как оральные контрацептивы, диуретики, иммуносупрессоры и противовоспалительные [15]. Снижение концентрации фолиевой кислоты происходит при употреблении алкоголя [16], курении, сахарном диабете и псориазе [17]. Уровень ГЦ нарастает и при наличии у пациентов полиморфизмов генов ферментов фолатного цикла.

Гомоцистеин и рак / Нomocysteine and cancer

Фолиевая кислота принимает участие не только в синтезе нуклеотидов. Она необходима и для превращения в тимидинмонофосфат дезоксиуридинмонофосфата (англ. deoxyuridine monophosphate, dUMP) [18]. Тимидилатсинтетаза (англ. thymidylate synthetase, TYMS) в норме осуществляет переход dUMP в тимидинмонофосфат, в качестве донора метильной группы выступает MTHFR. При дефиците фолиевой кислоты идет накопление dUMP, что приводит к дисбалансу дезоксирибонуклеотидов, избыточному включению урацила в ДНК вместо тимина. Данный дефект в норме устраняется ферментом урацил-ДНК-гликозилазой, которая удаляет ошибочно включенный урацил из цепи ДНК [19]. При резком снижении концентрации фолиевой кислоты (в связи с повышенной концентрацией ГЦ) ДНК-гликозилаза не справляется с репарацией ДНК, что приводит к хромосомным повреждениям и далее может привести к злокачественному перерождению клеток [20].

Метилирование ДНК имеет решающее значение для нормального генома. Параллельно метилированию ДНК гомоцистеин переходит в метионин под действием метионинсинтазы. Метилирование ДНК осуществляется с помощью донора метильной группы – S-аденозил-1-метионина (англ. S-adenosyl-1-methioni- ne, SAM), образуемого из метионина путем АТФ-зависимой реакции с участием S-аденозилметилсинтетазы [21]. Осуществляется метилирование ДНК совместно тремя типами ДНК-метилтрансфераз (англ. DNA methyltransferase, DNMT) – DNMT1, DNMT3a и DNMT3b. Поскольку SAM образуется из 5-метилтетрагидрофолата (англ. 5-methyltetrahydrofolate, 5'-MTHF), низкая концентрация фолиевой кислоты ограничивает доступность субстрата для метионинсинтазы, тем самым приводя к гипометилированию ДНК. Гипометилирование ДНК ведет к деконденсации гетерохроматина и активации элементов ретротранспозона [22]. Глобальное геномное гипометилирование встречается при многих видах рака, включая рак предстательной железы и гепатоцеллюлярную карциному. Регионарное гипометилирование последовательности ДНК также часто наблюдается на ранних стадиях онкогенеза и при доброкачественных состояниях, таких как гиперплазия [23].

При раке концентрация фолиевой кислоты в плазме крови снижается, так как опухолевые клетки используют ее для синтеза пуринов de novo [24]. При всех видах опухолей на поздних стадиях отмечены высокие концентрации ГЦ в плазме крови, в то время как на ранних стадиях значительных изменений в содержании ГЦ не выявлено. К резкому росту уровня ГЦ приводит и химиотерапия, на фоне которой отмечен рост тромбоэмболических осложнений. Наиболее часто используемые в химиотерапии препараты (например, антиметаболиты, метотрексат, гормоны и антагонисты) являются антифолатами [25]. Их применение вызывает дополнительное снижение концентрации фолиевой кислоты в плазме крови.

В проведенном нами исследовании было показано, что у 30,5 % (72/236) обследованных пациенток концентрация ГЦ в плазме крови составила ≥ 22 мкмоль/л. В исследовании преобладали пациентки II и III стадии заболевания.

Полиморфизмы генов фолатного цикла / Folate cycle gene polymorphisms

Резкое повышение концентрации ГЦ в плазме крови носит название гомоцистинурия. Состояние это связано с генетическим дефектом цистатионин-β-синтазы (CBS), фермента путей транссульфатирования и реметилирования в фолатном цикле [26]. Существует и ряд других генетических причин, приводящих к росту содержания ГЦ.

Многочисленные исследования доказали наличие мутаций и полиморфизмов генов ферментов участников обмена ГЦ (MTHFR, CBS, MTRR, MTR, MTHFD, BHMT, TYMS, TCN 2) [27–29]. Полиморфные аллели этих генов оказались ответственными за развитие дефектов нервной трубки плода и сосудистые осложнения [30][31]. Недавние исследования показали, что эти же полиморфизмы связаны с различными типами опухолей. Например, ген фермента MTHFR имеет около 6375 полиморфизмов, два из них – С677T [32] и А1298C [33] связаны с некоторыми опухолями, включая аденокарциному эндо- метрия. Ген фермента MTRR имеет 9461 полиморфизм. У гена фермента MTR выявлено 26150 полиморфизмов; один них – MTR A2756G, по данным некоторых исследований, сопряжен с развитием таких опухолей, например, как рак шейки матки и рак тела матки [34][35].

Однако в проведенном нами исследовании при оценке распространенности полиморфизмов генов ферментов фолатного цикла (MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR A66G, MTR A2756G) достоверных различий в частоте полиморфизмов в группе онкогинекологических пациенток и контрольной группе выявлено не было (р > 0,05). Возможно, отсутствие различий объясняется особенностями исследуемой популяции, либо размерами выборки.

Рак и онкотромбозы / Cancer and oncothrombosis

На поздних стадиях у онкологических пациентов развиваются как ГГЦ, так и ВТЭ [36]. Пациенты после химиотерапии составляют 13 % от общего пула ВТЭ и имеют повышенные концентрации ГЦ в плазме крови [37]. Есть основания полагать, что существует тесная связь между гомоцистеин-индуцированной ВТЭ и раком.

Лежащий в основе рак-ассоциированного тромбоза механизм, индуцированный ГГЦ, является сложным и не до конца изученным. Эндотелиальные нарушения, вызванные образованием свободных радикалов, могут быть одним из компонентов этого механизма [38]. ГЦ способен формировать димеры и комплексы с белком, способствующие появлению свободных радикалов. ГЦ также может образовывать активное производное под названием гомоцистеин-тиолактон. Гомоцистеин-тиолактон формирует ковалентные связи с остатками лизина или аргинина в белках, что приводит к образованию нерастворимых белковых агрегатов или амилоидов [39], нарушающих нормальную работу сердечно-сосудистой системы. Модификация гемостатических протеинов (путем N-гомоцистеинилирования или S-гомоцистеинилирования) препятствует нормальному обмену оксида азота (NO) и вызывает повреждение клеток эндотелия [40].

Гомоцистеин нарушает работу тромбомодулина и протеин С-зависимую инактивацию фактора Va [41], снижает секрецию NO, приводит к усилению агрегации тромбоцитов и уменьшению антитромботической активности эндотелиальных клеток [42].

При повышении концентрации ГЦ его свободная тиоловая группа вызывает окислительный стресс и активирует тромбоциты, что приводит к эндотелиальной дисфункции, повреждению стенки сосудов и тромбозу. ГЦ также может вызывать гомоцистеинилирование белков, образуя аминные связи с остатками лизина, изменяя структуру и функцию белков и вызывая повреждение белков через тиоловые радикалы, что также приводит к тромбозу [43].

Гомоцистеин увеличивает синтез реактивных форм кислорода с последующим формированием гидроксильных радикалов, способствующих окислению липидов, белков, углеводов и нуклеиновых кислот, развитию эндотелиальной дисфункции, повреждению сосудистой стенки и, в конечном итоге, к активации тромбоцитов и тромбозу [44]. На фоне дефицита фолиевой кислоты происходит нарушение обмена метионина, что приводит к накоплению ГЦ в организме [45].

Результаты нашего исследования показали, что частота тромботических осложнений у онкогинекологических пациенток составила 15,3 % (36/236), при этом 33,3 % (12/36) пациенток имели высокую концентрацию ГЦ крови. При проведении логистической регрессии определено, что риск ВТЭ в 2,99 раза выше у пациенток с содержанием ГЦ в плазме крови ≥ 22 мкмоль/л по сравнению с пациентками с концентрацией ГЦ < 22 мкмоль/л (95 % ДИ = 1,11–8,08). У онкогинекологических пациенток с выявленными полиморфизмами генов ферментов фолатного цикла средний уровень ГЦ в плазме крови оказался достоверно выше, чем в контрольной группе женщин с полиморфизмами (р < 0,05).

Таким образом, концентрация ГЦ в плазме крови является независимым фактором риска ВТЭ в онкогинекологии. Влияние фолиевой кислоты на риск тромбоза может быть обусловлено участием в реметилировании ГЦ [46][47]. Следовательно, имеет смысл рассмотреть необходимость обогащать рацион пациенток фолиевой кислотой, контролировать уровень ГЦ в плазме крови и использовать соответствующие препараты, содержащие достаточные дозы фолиевой кислоты при ведении онкологических пациентов.

Ограничения исследования / Study limitations

Было проведено одноцентровое ретроспективное исследование, с анализом ограниченного количества архивного материала. Кроме того, в этом исследовании не рассматривалась возможная роль фолиевой кислоты, витамина B12 как кофермента метаболического пути ГЦ.

Установлены достоверные различия в концентрации ГЦ в плазме крови у онкогинекологических пациенток с тромботическими осложнениями и без них. Терапевтический эффект фолиевой кислоты на уровень ГЦ у онкогинекологических пациенток может быть использован в качестве дополнительной тромбопрофилактики в группах риска.

Значимого увеличения частоты встречаемости полиморфизмов генов ферменов фолатного цикла среди онкогинекологических пациенток выявлено не было, что позволяет усомниться в том, что данные полиморфизмы участвуют в патогенезе опухолей данной локализации. При этом у пациенток с повышенной концентрацией ГЦ в плазме крови полиморфизмы определяли достоверно чаще.

Объективные факты свидетельствуют о существовании генетических, эпигенетических и экологических причин нарушения обмена ГЦ у онкологических пациентов. Необходимо и далее рассматривать возможность назначения препаратов, снижающих содержание ГЦ в крови, и проводить мониторинг его концентрации у онкологических пациентов на фоне терапии, в том числе и химиотерапии. На сегодняшний день влияние ГЦ на рост и пролиферацию опухолевых клеток остается плохо изученным. Возможно, работы в этом направлении будут потенциально эффективны в разработке новых противоопухолевых стратегий.