Одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности женского населения занимает рак молочной железы (РМЖ). Ежегодно в мире регистрируется свыше 2 млн новых случаев заболевания и при этом на долю РМЖ приходится около 12 % от всей вновь выявленной онкопатологии [1]. В Российской Федерации (РФ) РМЖ ежегодно диагностируется более чем у 60 тыс. женщин [2]. Следует заметить, что наибольшее количество женщин, заболевших РМЖ в России (более 1/3), регистрируется в возрастных группах 60–64 года (11283 человек) и 65–69 лет (11712 человек) (данные 2018 г.) [3]. Следует отметить значимую роль РМЖ и в структуре смертности женского населения – ежегодно в РФ у 14 женщин на 100 тыс. человек РМЖ является причиной смерти [3]. При этом наиболее высокий удельный вес РМЖ в структуре смертности женского населения наблюдается в возрастных группах 35–39 лет (22,71 %), 40–44 года (22,60 %), 45–49 лет (23,01 %), 50–54 года (22,44 %), т. е. практически каждая четвертая-пятая женщина, умершая в возрасте 35–54 года, имеет причиной смерти РМЖ [3].

Согласно современным данным, полученным на основе близнецовых исследований, вклад генетических факторов в возникновение РМЖ весьма значителен и составляет не менее 30 % [4]. Вместе с тем проведенные к настоящему времени полногеномные исследования РМЖ и выявившие порядка 200 по лиморфизмов различных генов-кандидатов [5], связанных с развитием заболевания, «обьясняют» лишь 18 % наследуемости РМЖ [6]. Таким образом, значительная часть наследственных детерминант РМЖ остается на сегодняшний момент времени неизвестной, и необходимы дальнейшие исследования по поиску генетических факторов, определяющих подверженность заболеванию.

Среди генов-кандидатов для РМЖ, связь которых с заболеванием априорно имеет «серьезное» патофизиологическое обоснование, особое место занимают гены матриксных металлопротеиназ [7–9]. Белки, контролируемые этими генами (матриксные металлопротеиназы; англ. matrix metalloproteinases, ММР), за счет своих выраженных функциональных эффектов, направленных на процессы ремоделирования внеклеточного матрикса [10][11], имеют важное значение в патофизиологии РМЖ, влияя на процессы роста и метастазирования опухоли [11–13]. Получены убедительные данные о связи продукции ряда ММР в очаге поражения с индукцией роста и инвазии опухоли, более активным ее метастазированием, плохой выживаемостью больных РМЖ [7][11][13]. Однако при этом, несмотря на достаточно большое число ассоциативных исследований связи полиморфизма генов ММР, проведенных на настоящий момент времени (в базе данных PubMed/MEDLINE представлены материалы более 50 таких исследований), результаты этих работ зачастую не согласуются между собой. Так, например, среди четырех генетикоэпидемиологических исследований связи rs1940475 (C>T) гена ММР8 с РМЖ лишь в одной работе установлена его ассоциация с заболеванием (метастазирование РМЖ) [14], тогда как в трех исследованиях достоверных данных о вовлеченности данного полиморфизма в формирование РМЖ получено не было [15–17]. Для rs243865 (C>T) гена MMP2 в 8 исследованиях была выявлена ассоциация с РМЖ, а в 13 работах такой связи не обнаружено [18–20]. Изложенные выше факты определяют важность дальнейших генетико-эпидемиологических исследований РМЖ в различных популяциях и в том числе в России с целью выявления «причинных» генетических факторов РМЖ.

Цель: изучить ассоциации полиморфизма генов ММР2, ММР8, ММР9 с тяжелым течением РМЖ.

Дизайн исследования / Study design

Ретроспективное сравнительное исследование проведено на выборке 345 больных РМЖ. Выборка больных РМЖ формировалась на базе ОГБУЗ «Белгородский областной онкологический диспансер» за период 2010–2016 гг.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения: наличие впервые выявленной карциномы молочной железы; русская национальность (самоидентификация); место рождения/ проживания в Центрально-Черноземном районе (ЦЧР) России [21, 22]; отсутствие родственных связей между собой. Критерии исключения: иные морфологические варианты РМЖ (не карцинома); не русская национальность; родившиеся/проживающие вне ЦЧР России, являющиеся родственниками больных РМЖ, включенных в исследование.

Группы обследованных / Study groups

Для верификации диагноза РМЖ проводилось патогистологическое исследование полученных интраоперационно образцов опухоли [23]. Стадирование РМЖ (патоморфологическое) осуществлялось согласно клиническим рекомендациям «Рак молочной железы» [24]. Стадия I была выявлена у 64 пациенток, стадия II – у 190, стадия III – у 72 и стадия IV – у 19 больных. С целью повышения мощности проводимого ассоциативного анализа все больные были объединены в 2 группы: пациентки с I и II стадиями заболевания (n = 254) и пациентки с III и IV стадиями (n = 91). Средний возраст больных с I и II стадиями РМЖ составил 54,54 ± 12,68 лет (min – 25 лет, max – 84 года), III и IV стадиями – 53,76 ± 12,96 лет (min – 31 год, max – 81 год) (pMann–Whitney = 0,68).

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проведено согласно стандартам надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципам Хельсинской декларации с информированного (письменного) согласия обследуемых. Протокол исследования предварительно до его проведения был одобрен этическим комитетом медицинского института НИУ БелГУ (протокол № 4 от 11.04.2012).

Методы молекулярно-генетического анализа / Мolecular genetic analysis

При проведении генетического тестирования были использованы образцы ДНК больных РМЖ (выделялись фенольно-хлороформным методом из образцов венозной крови) [25]. Выполнено генотипирование трех однонуклеотидных полиморфных локусов генов ММР2 (C>T rs243865), ММР8 (C>T rs1940475), ММР9 (C>T rs3918242), отобранных для данного исследования на основе определенных критериев: «доказанная» их ассоциация с РМЖ в ранее проведенных ассоциативных исследованиях [15–20], наличие регуляторного (эпигенетического) потенциала (оценен in silico с помощью биоинформатической базы HaploReg [26] согласно ранее представленной методике) [27]. Для генотипирования полиморфизмов использовались реагенты ООО «Тест-Ген» (Ульяновск, Россия), методика генетического исследования представлена ранее [28].

Методы статистического анализа / Statistical methods

Сравнительный анализ распределения генотипических классов (наблюдаемое и ожидаемое) пяти рассматриваемых полиморфизмов генов MMP в изучаемых группах больных проводили на основе «общепринятого» в генетических исследованиях закона Харди–Вайнберга [29]. При изучении ассоциации генетических маркеров с РМЖ тяжелого течения применялся метод логистической регрессии [30]. Вычисления показателей отношения шансов (ОШ) и их 95 % доверительного интервала (95 % ОШ), уровня статистической значимости на основе пермутационных процедур (pperm) [31] были выполнены в рамках четырех генетико-статистических моделей (аллельная, рецессивная, доминантная, аддитивная) с учетом ковариаты «возраст больной» в программном обеспечении PLINK [32]. Статистически значимым считался уровень pperm < 0,05 [33]. Для полиморфизма ММР, продемонстрировавшего значимые ассоциации с РМЖ тяжелого течения, проведен детальный in silico анализ функциональных эффектов с помощью биоинформатических баз HaploReg [26], GTEx Portal [34].

Анализ соотношения между наблюдаемым и ожидаемым распределением генотипических классов по трем полиморфизмам генов MMP среди больных РМЖ I–II и III–IV стадиями заболевания не выявил достоверных отклонений (p > 0,05).

Ассоциации полиморфных локусов генов ММР с раком молочной железы / Associations between MMP gene polymorphic loci and breast cancer

Полученные нами данные указывают на связь минорного аллельного варианта Т полиморфизма rs1940475 (С>Т) гена MMP8 с РМЖ тяжелого течения (III–IV стадии заболевания) в рамках аллельной (T vs. С; ОШ = 0,71; 95 % ДИ = 0,51–1,00; p = 0,050; pperm = 0,050) и аддитивной (TT vs. СТ vs. CC; ОШ = 0,69; 95 % ДИ = 0,48–0,99; p = 0,047; pperm = 0,048) генетических моделей (табл. 1). При этом следует отметить, что если альтернативный аллель rs1940475 MMP8 (аллель Т) ассоциирован с низким риском развития РМЖ более тяжелого течения (ОШ < 1), то соответственно референсный для него аллель С rs1940475 будет являться генетическим фактором риска утяжеления течения РМЖ (развитие III–IV стадий заболевания) (ОШ = 1,43; 95 % ОШ = 1,00–2,04; p = 0,050; pperm = 0,050). Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при наличии у больных РМЖ I–II стадий генетического варианта С rs1940475 MMP8 риск прогрессирования у них заболевания и развития РМЖ III–IV стадий будет более чем в 1,4 раза выше. Статистически значимых различий в распределении аллелей и генотипов полиморфных локусов генов ММР2 (C>T rs243865) и ММР9 (C>T rs3918242) между больными РМЖ III–IV стадий и I–II стадий не выявлено (pperm > 0,05) (табл. 1).

Функциональные эффекты полиморфизма rs1940475 гена MMP8, связанного с развитием рака молочной железы III–IV стадий / Functional effects of the rs1940475 polymorphism in the MMP8 gene associated with developing stage III–IV breast cancer

Материалы базы данных по эпигенетике HaploReg указывают на важное функциональное значение полиморфизма rs1940475 гена MMP8 в организме. Во-первых, нуклеотидная замена C>T находится в экзонном участке гена MMP8 (миссенс-мутация) и обусловливает замену аминокислоты лизин на глутаминовую аминокислоту в 87 положении в полипептиде MMP8 (Lys87Glu). Во-вторых, rs1940475 (С>Т) гена MMP8 находится в области «отрытого» хроматина (функционально активный участок генома человека), который выполняет роль энхансера в клетках периферической крови (нейтрофилы, моноциты, мононуклеарные клетки и др.), а также, что является чрезвычайно важным (!), в первичных клетках эпителия молочной железы (англ. мammary еpithelial рrimary сells, HMEC, Epigenome ID: E119, Mnemonic: BRST.HMEC), т. е. этот полиморфизм проявляет выраженный регуляторный потенциал в органе-мишене при РМЖ – молочной железе. В-третьих, rs1940475 (С>Т) гена MMP8 локализован в участке взаимодействия «отрытого» хроматина с тремя транскрипционными факторами – CIZ, Myc, NF-AT1. При этом аллель Т, связанный с низким риском развития III–IV стадий заболевания у больных РМЖ, «улучшает» (повышает аффинность) взаимодействие регуляторного участка ДНК с факторами транскрипции CIZ и Myc и снижает его аффинность к фактору транскрипции NF-AT1. В-четвертых, материалы онлайн базы GTEx Portal указывают на ассоциацию rs1940475 (С>Т, ниже приведены показатели β для аллельного варианта С) с транскрипционной активностью гена ММР27 в подкожной жировой ткани (β = –0,15; р = 6,80×10–12) и гена RP11-817J15.3 в периферической крови (β = 0,17; р = 5,50×10–8) и печени (β = –0,44; р = 0,0000038). Итак, вышеуказанные данные демонстрируют связь протективного для развития III IV стадий РМЖ аллельного варианта Т rs1940475 с повышенной экспрессией гена ММР27 в подкожной жировой и мышечной тканях, гена RP11-817J15.3 в печени и с пониженной экспрессией генов ММР27 и RP11-817J15.3 в периферической крови.

Проведенный нами анализ литературных материалов по вовлеченности полиморфизма rs1940475 (С>Т) гена MMP8 в формирование РМЖ показал, что на настоящий момент времени в базе данных PubMed/ MEDLINE представлены результаты лишь 4 работ по этой теме [14–17], что свидетельствует о «слабой» изученности того вопроса и подчеркивает новизну и актуальность выполненного нами исследования. Полученные в настоящей работе данные о протективном значении аллельного варианта Т rs1940475 (С>Т) гена MMP8 для формирования РМЖ III–IV стадий у населения европейской части России полностью согласуются с результатами работы J. Decock с соавт. [14], выполненной также в европейской популяции (изучалось население Бельгии). Авторы показали протективную роль аллеля Т rs1940475 MMP8 в развитии метастазов у больных РМЖ (OШ = 0,60). Вместе с тем в трех других исследованиях, выполненных как в европейских [15][16], так и в азиатской [17] популяциях, достоверных данных о связи rs1940475 (С>Т) гена MMP8 с РМЖ не получено. Наряду с этим имеются литературные данные о вовлеченности rs1940475 (С>Т) гена MMP8 в патогенетику ряда других онкологических заболеваний (рак желудка, мочевого пузыря и др.) [35].

Интересным представляется факт того, что сильно сцепленный (r2 = 0,84) с rs1940475 MMP8 полиморфизм rs11225395, согласно имеющимся литературным данным, также ассоциирован с риском развития РМЖ, его стадийностью, метастазированием и выживаемостью больных [14][17]. Причем эти данные получены как для европейского [14], так и для азиатского [14][17] населения. Кроме этого, показано, что аллельный вариант Т (по сравнению с аллелем С) полиморфизма rs11225395 (локализуется в промоторной области гена MMP8 рядом с сайтом инициации транскрипции) коррелирует практически с двукратным увеличением активности промотора в клетках рака молочной железы (экспериментальная модель клеток MDA-MB-231) [14]. Также продемонстрировано, что участок ДНК, в котором расположен полиморфизм rs11225395, при наличии аллеля T участвует во взаимодействии с ядерными регуляторными белками в MDA-MB-231 клетках РМЖ, а при его отсутствии (наличие аллеля С) ДНК-белковое взаимодействие не происходит [14]. Вышеуказанные экспериментальные данные свидетельствуют о «ключевой» регуляторной роли участка генома, являющегося местом локализации rs11225395 и исследуемого в настоящей работе rs1940475 гена MMP8, и его вовлеченности в процессы метастазирования РМЖ [14][35].

Продуктом экспрессии гена MMP8 является эндопептидаза – матриксная металлопротеиназа 8 (нейтрофильная коллагеназа), биологическое значение которой заключается в гидролитическом расщеплении различных фибриллярных/нефибриллярных коллагенов [14][35]. Следует подчеркнуть, что коллагены являются одним из «основополагающих» компонентов экстрацеллюлярного (внеклеточного) матрикса в организме [14][35]. Согласно имеющимся литературным данным, противоопухолевое действие MMP8 может реализовываться как вследствие ее влияния на одного из представителей семейства эфриновых белков – эфрин-B1, приводящее к его расщеплению (эфрин-B1 играет важную роль в передаче сигналов, регулирующих клеточную адгезию и ангиогенез), так и за счет регуляции активности экспрессии трансформирующего фактора роста (англ. transforming growth factor, TGF-β1) посредством влияния на путь PI3K/Akt/Rac1 [35]. При этом следует отметить некоторую неоднозначность данных о связи уровня ММР-8 с РМЖ [35].

Аллельный вариант Т rs1940475 (C>T) гена ММР8 является протективным фактором (OШ = 0,69–0,71) развития III–IV стадий РМЖ. Данный полиморфизм определяет аминокислотную замену в белке MMP8 (р.K87E) и связывание ДНК с транскрипционными факторами NF-AT1, MYC и CIZ, ассоциирован с экспрессией генов ММР27 и RP11-817J15.3, находится в энхансерном регуляторном участке в первичных эпителиальных клетках молочной железы. Однонуклеотидный полиморфизм ММР2 (C>T rs243865), ММР9 (C>T rs3918242) не ассоциирован с тяжелым течением РМЖ (III–IV стадии).