Преэклампсия (ПЭ) описывается как комплексное расстройство в системе «мать–плацента–плод», затрагивающее все системы органов как матери, так и плода, возникает после 20 нед беременности, характеризуется артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией, а при тяжелом течении – явлениями полисистемной недостаточности. В литературе описано и проанализировано более 20 специфических биомаркеров, дисбаланс которых может рассматриваться как предикция развития ПЭ [1][2]. При этом роль гемостатических реакций в формировании акушерской патологии, в том числе ПЭ, неоспорима и изучается на протяжении многих десятилетий. Результаты исследований свидетельствуют о том, что вклад нарушений в различных звеньях системы гемостаза определяет 5–15 % плацентарных осложнений, при этом ключевая роль в их инициации принадлежит повышенному образованию тромбина [3][4]. Предполагается, что один из механизмов повышения тромбинообразования заключается в избыточном синтезе и высвобождении тканевого фактора (англ. tissue factor, TF) [5][6]. При этом источник повышенной экспрессии TF до настоящего времени не совсем ясен, поскольку он может выделяться тромбоцитами и моноцитами крови в ответ на действие провоспалительных цитокинов, эндотелием сосудов и плацентой [7][8].

Необходимо отметить, что трофобласт характеризуется повышенной экспрессией TF на протяжении всей беременности. Однако в отличие от эндотелия кровеносных сосудов, который экспрессирует TF только при воспалительных и протромботических стимулах, клетки трофобласта конститутивно экспрессируют TF, проявляя, таким образом, даже в условиях физиологической беременности признаки активированного эндотелия. Системное влияние TF реализуется через контакт клеток трофобласта, экспрессирующих TF, с переносимыми материнской кровью факторами VII и X, что активирует их и инициирует образование тромбина [9]. Тромбин, в свою очередь, может реализовывать свое действие как локально, ингибируя пролиферацию и регулируя инвазивность клеток трофобласта, так и системно – вместе с фибриногеном и фактором XIII, финализируя каскад коагуляции.

Другими словами, локальное повышение генерации тромбина определяет образование фибрина и формирование фибриновых отложений [7][10]. Как известно, именно избыточное отложение фибрина в межворсинчатом пространстве является одной из причин недостаточной инвазии ворсин хориона в гравидарный эндометрий, что ведет к нарушению процессов имплантации и впоследствии к неадекватной перфузии, которая при длительном существовании, как правило, реализуется в изменении линейных размеров антенатальной плаценты, визуализируемой при выполнении ультразвукового исследования (УЗИ) [11]. Учитывая вышеизложенное, нам представилось необходимым рассмотреть параметры коагуляционного гемостаза в качестве биомаркеров прогнозирования ранней ПЭ (рПЭ). Как правило, данный вид патологии манифестирует у пациенток группы низкого риска ее развития, имеет тяжелое клиническое течение и неблагоприятный прогноз как для матери, так и для новорожденного [12].

Цель: определение роли отдельных параметров коагуляционного гемостаза в реализации тяжелой рПЭ в группе пациенток низкого риска ее развития.

Дизайн исследования / Study design

Выполнено одноцентровое проспективное исследование с включением 90 пациенток в сроки гестации 19–21 нед. На этапе формирования когорты исследования основную группу составили 50 беременных низкого риска развития ПЭ по результатам расчетов калькулятора FMF (англ. Fetal Medicine Foundation; Фонд медицины плода) в сроки гестации 11–13 нед, но с показателем индекса плацентарного отношения (англ. placental ratio index, PRi) ≥ 7, рассчитанного в сроки гестации 19–21 нед. PRi – это интегральный показатель, отношение длины (Lp) плаценты к ее толщине (Thp), измеренных в миллиметрах (PRi = Lp/Thp), полученный нами ранее по результатам исследования, направленного на поиск ультразвуковых маркеров развития рПЭ в сроки гестации 19–21 нед в группе беременных низкого риска по результатам расчетов калькулятора FMF при первом скрининге. При значении PRi ≥ 7 развитие рПЭ, как было показано, может прогнозироваться в 91,3 % случаев: чувствительность (англ. sensitivity, Se) = 90 %, специфичность (англ. specificity, Sp) = 87,5 % [13].

Контрольная группа представлена 40 соматически здоровыми женщинами с физиологическим течением беременности, родами в срок новорожденными без признаков гипотрофии.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion сriteria

Критерии включения в основную группу: возраст женщины 18–35 лет; первые предстоящие роды; беременность одним плодом; отсутствие соматических заболеваний (артериальная гипертензия, сахарный диабет); индекс массы тела не более 25 до момента вступления в беременность; показатель PRi ≥ 7 в сроки гестации 19–21 нед.

Критерии исключения из основной группы: беременность как результат использования программ вспомогательных репродуктивных технологий; репродуктивные потери в анамнезе после 22 нед беременности; личная история ПЭ; соматические заболевания, такие как артериальная гипертензия, сахарный диабет; генетическая или приобретенная тромбофилия.

Методы исследования / Study methods

Исследование коагуляционного гемостаза / Study of coagulation hemostasis

Все женщины, включенные в исследование, наряду с применением регламентированных методов – активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), содержание фибриногена, протромбиновое (тромбопластиновое) время (ПВ), количество тромбоцитов [14], были обследованы в сроки гестации 19–21 и 27–28 нед на уровень отдельных параметров коагуляционного звена гемостаза: TF, ингибитор пути тканевого фактора (англ. tissue factor pathway inhibitor, TFIP), способность к тромбинообразованию в тесте калиброванной тромбографии по показателям: пиковая концентрация тромбина (Рeak thrombin, нмоль/л) – максимальная концентрация тромбина, достигаемая в процессе его генерации в образце), и эндогенный тромбиновый потенциал (еndogenous thrombin potential, ETP, нмоль/мин) – площадь под кривой генерации тромбина.

Для количественного определения активности TF использовали набор реагентов Actichrome® TF (Bio Medica Diagnostics, США), а активности TFPI – Actichrome® TFPI того же производителя. При исследовании генерации тромбина использовали планшетный флуориметр Fluoroskan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Финляндия) с программным обеспечением Thrombinoscope 3.0.0.26. Коагуляция исследуемой плазмы крови осуществлялась в присутствии 5,0 пмоль тканевого фактора и 4 мкмоль фосфолипидов (PPP-Reagent 5 pM, Thrombin Calibrator, FluCaKit, Нидерланды) [15].

Из принятых в исследование 50 пациенток основной группы тяжелая рПЭ развилась в 41 наблюдении; две пациентки выбыли из исследования по причине переезда в другой регион; у двух пациенток реализовались спонтанные преждевременные роды в 34 нед; 5 беременных родоразрешены в доношенном сроке гестации: 4 – оперативным путем (1 случай – преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, 3 эпизода – аномалии родовой деятельности), и только в одном наблюдении роды были через естественные родовые пути. По факту родоразрешения заявленные тесты коагуляционного гемостаза выполнены 41 женщине основной группы и 40 пациенткам группы контроля.

Ультразвуковое исследование / Ultrasound examination

УЗИ выполнялось, как минимум, двумя специалистами, имеющими сертификаты FMF, на сканере экспертного класса GE Voluson E10 (GE Healthcare, Австрия) трансабдоминально с использованием конвексного объемного датчика RAB6-D с частотой 2–8 МГц. Квалификация специалистов позволяла проводить расчеты риска акушерских осложнений при помощи акушерско-гинекологического модуля базы данных Astraia (Astraia Software Gmbh, Германия).

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследование проведено в соответствии с этическими стандартами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и ее последующими изменениями. Дизайн и методы исследования обсуждены и одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России, протокол № 8 от 25.10.2019. Перед отбором биологического материала (периферическая кровь) каждая участница исследования подписала информированное согласие.

Методы статистического анализа / Statistical analysis

Распределение полученных данных на нормальность с учетом малого объема выборки в группах сравнения определялось с использованием критерия Шапиро–Уилка (Shapiro-Wilk’s W-test). Качественные данные, включая номинальные, представлены абсолютные числами (n), описанные расчётом их доли (%) в анализируемой выборке. Сравнительный анализ качественных данных в двух независимых выборках проводился посредством заполнения таблиц сопряженности и расчета точного теста Фишера. Пороговый значимый уровень различий (p) определен на уровне p < 0,05. Ряд анализируемых данных представлен непрерывными рядами (лабораторные показатели; данные о весе новорожденных, плацент, пациенток; показатели артериального давления и протеинурии), которые в большинстве своем не имели нормального распределения Гаусса, что определило выбор методов непараметрической статистики для анализа; эти данные представлены в виде медианы (Ме), 95 % доверительного интервала (95 % ДИ) для медианы и интерквартильного размаха [Q1–Q3]. Для определения чувствительности и специфичности теста проводили ROCанализ (англ. Receiver Operating Characteristic) с расчетом площади под кривой (англ. Area Under Curve, AUC), отражающей качество диагностического теста. Для статистической обработки данных использовали пакет программного обеспечения MedCalcVersion 17.9.7 (MedCalc Software LTD, Бельгия).

Клинико-анамнестическая характеристика обследованных / Clinical and anamnestic characteristics of the patients examined

Анализируемые группы были идентичны по возрасту, паритету и соматической патологии (табл. 1). Течение I триместра беременности было благоприятным у женщин обеих групп. Только в основной группе во II триместре беременности зарегистрирован гестационный сахарный диабет в 5 наблюдениях, что не имело достоверной разницы с группой контроля. При этом уровень глюкозы в плазме крови у пациенток корригировался сбалансированной диетой. Среднее давление как систолическое, так и диастолическое у пациенток основной группы было значимо больше, а протеинурия определялась только у пациенток c реализованной ПЭ. Также женщины в группе с ПЭ имели значимо меньший гестационный срок родоразрешения и массу тела новорожденных по сравнению с женщинами с физиологической беременностью.

Результаты исследования коагуляционного гемостаза / The results of examining coagulation hemostasis

Ключевым моментом нашей работы явилось определение отдельных параметров коагуляционного гемостаза при реализации рПЭ в группе низкого риска. При анализе уровня прокоагулянтной активности TF определено, что в группе пациенток с реализованной рПЭ она превышала аналогичный в группе контроля в 9,2 раза (рис. 1А). При анализе уровня ингибитора TF (TFPI) выявлена обратная тенденция: в сроке гестации 19–21 нед активность TFPI в основной группе определена в 1,5 раза ниже, чем в группе контроля, а к сроку 27–28 нед, т. е. за 1–3 недели до реализации ПЭ показатель TFPI по медиане оказался сопоставимым с таковым в группе контроля, при этом его уровень значимо увеличивался (82,0 %) относительно точки 19–21 нед (рис. 1В).

Анализ способности к генерации тромбина в тесте калиброванной тромбографии выявил следующие закономерности. В группе женщин с реализованной рПЭ отмечено достоверное повышение тромбинообразования по показателям «Пик тромбина – Peak thrombin» (рис. 2А) и «Эндогенный тромбиновый потенциал – ETP» (рис. 2В). При этом в сроке беременности 19–21 нед определена достоверная значимая корреляция умеренной силы между показателем коагуляционной активности TF и показателем Peak thrombin (r = 0,58; p = 0,0375).

Критерии для прогнозирования развития ранней преэклампсии / Criteria to predict developing early preeclampsia

Учитывая значимые различия анализируемых параметров в группах сравнения, проведен комбинированный ROC-анализ для выявления наиболее чувствительного критерия для прогнозирования развития рПЭ в сроки гестации 19–21 нед (рис. 3).

Установлено, что все анализируемые тесты имеют высокую прогностическую значимость, однако при уровне активности TF более 14,74 пмоль/мл риск развития ПЭ в сроки 19–21 нед у пациенток с PRi ≥ 7 прогнозируется в 100 % случаев (95 % ДИ = 0,947–1,000; р < 0,0001), что позволяет рассматривать TF в представленной когорте беременных идеальным прогностическим биомаркером.

Наше предположение о роли TF в патогенетическом каскаде развития ранней (плацентарной) ПЭ основано на представлении биологического действия TF и тромбина на многоступенчатый процесс становления плаценты. Как известно, TF наряду с основной функцией – инициацией каскада свертывания крови участвует также в развитии асептического воспаления, инвазии хориона и ангиогенезе – основных звеньев патогенеза ПЭ [16]. Предметом научных дискуссий в литературе являются 2 направления. Во-первых, роль TF в развитии осложнений, связанных с нарушением становления плаценты, во-вторых, вклад повышенной активности и/или уровня TF в плазме крови в усиление тромбинообразования у пациенток с реализованной ПЭ.

Имеется ряд работ, свидетельствующих о повышенном уровне TF в группе женщин с реализованной ПЭ в сроке гестации 36 и более недель при неизменном уровне его естественного ингибитора TFPI [4][17]. Другие же авторы делают акцент на изменение уровня/активности TFPI в плазме крови у беременных с реализованной ПЭ. При этом чаще исследователи отмечают повышение уровня последнего показателя: при реализации поздней ПЭ после 36 нед [18–20], либо с 24 нед гестации при отсутствии достоверной разницы между уровнем TFPI в группе с ПЭ и без таковой до 20 нед беременности [21]. Тем не менее ряд работ свидетельствуют о снижении показателя TFPI в плазме крови в когорте женщин с осложнениями гестации, включая тяжелую ПЭ [17].

В представленном нами исследовании в группе женщин с реализованной рПЭ отмечено значимое повышение уровня TF как в 19–21 нед, так и в 27–28 нед беременности. Показатели TFPI в 19–21 нед (на стадии клинического благополучия) определены в группе пациенток с ПЭ как значимо более низкие относительно группы контроля с достоверным ростом показателя на 82 % к сроку 27–28 нед, т. е. за 1–3 недели до клинической манифестации. По нашему мнению, динамическое повышение уровня TFPI является вторичным и связано с несколькими моментами: нарастающим повышением уровня TF в плазме крови [21] и дисбалансом в системе протеина С, а именно, со снижением резистентности фактора Va к активированному протеину C и снижением уровня протеина S – специфичные изменения для пациенток с ПЭ [22][23].

Способность к повышенному тромбинообразованию при развитии ПЭ в доступных для анализа работах оценивали посредством проведения теста калиброванной тромбографии. По данному вопросу выводы исследователей единодушны: у пациенток с реализованной ПЭ в сроки гестации 36 нед и более отмечаются значимо более высокие значения показателей Peak thrombin и ETP [24][25], что согласуется с результатами представленного исследования. Кроме того, нами проведена оценка линейных связей между показателями Peak thrombin и TF, результаты которой свидетельствует о наличии прямой положительной корреляционной связи умеренной силы, что подтверждает участие TF в инициации тромбинообразования и совпадает с мнением других исследователей [4].

Отличительной особенностью представленной работы является динамическое исследование показателей, описывающих состояние коагуляционного гемостаза у пациенток, определенных в группу низкого риска развития рПЭ по результатам расчётов калькулятора FMF в I триместре. Как известно, именно группа низкого риска является наиболее уязвимой в реализации ранней, так называемой плацентарной ПЭ. Для проведения исследования коагуляционного гемостаза выделена когорта беременных с неудовлетворительными результатами плацентометрии в сроки гестации 19–21 нед, что является следствием неадекватной инвазии и/или перфузии плаценты, и вне зависимости от причин, первично вызвавших данное нарушение, в конечном счете реализуется избыточным тромбинообразованием на локальном уровне и отложением фибрина в межворсинчатом пространстве [26]. Необходимо отметить также, что в клинической практике отклонение от референтных значений линейных измерений плаценты по данным УЗИ является предметом научных дискуссий, но не является предпосылкой для пересмотра риска развития осложнений гестации.

Полученные в представленной работе результаты в части прогностической способности уровня прокоагулянтной активности TF в сроки гестации 19–21 нед позволяют рассмотреть возможность дополнения стратегии скрининга у пациенток с неудовлетворительными результатами плацентометрии, а именно, с показателем PRi ≥ 7. Также достаточно интересным выглядит возможность коррекции повышенного образования тромбина низкомолекулярным гепарином на доклинических стадиях развития рПЭ.

Результаты представленного исследования расширяют представления о роли отдельных параметров коагуляционного гемостаза в реализации рПЭ. Определено значимое повышение способности к тромбинообразованию по результатам калиброванной тромбографии в сроке 19–21 нед по показателю Peak thrombin в 1,9 раза и показателю ETP в 2 раза. Наличие положительной корреляционной связи умеренной силы между показателями Peak thrombin и TF подтверждает участие TF в инициации тромбинообразования и позволяет рассматривать его в качестве прогностического биомаркера развития рПЭ. Кроме того, перспективным выглядит представление повышенной генерации тромбина в качестве биологической мишени для таргетного терапевтического воздействия низкомолекулярным гепарином, что требует проведения дальнейших исследований.