Надежда Александровна Орлова – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих.
Пр. 60-летия Октября, 7, корп. 1, Москва, 117312
Nadezhda Alexandrovna Orlova – PhD, Research Associate, Laboratory of Bioengineering of Mammalian Cells.
Pr. 60-letiya Oktyabrya, 7, korp. 1, Moscow, 117312
Сергей Владимирович Ковнир – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих.
Пр. 60-летия Октября, 7, корп. 1, Москва, 117312
Sergey Vladimirovich Kovnir – PhD, Research Associate, Laboratory of Bioengineering of Mammalian Cells.
Pr. 60-letiya Oktyabrya, 7, korp. 1, Moscow, 117312
Юлия Александровна Ходак – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих.
Пр. 60-летия Октября, 7, корп. 1, Москва, 117312
Yulia Alexandrovna Khodak – PhD, Research Associate, Laboratory of Bioengineering of Mammalian Cells.
Pr. 60-letiya Oktyabrya, 7, korp. 1, Moscow, 117312
Михаил Александрович Ползиков – кандидат химических наук, генеральный директор.
Научный проезд, 20, стр. 2, Москва, 117246
Mikhail Alexandrovich Polzikov – PhD, General Director.
Nauchnyi proezd, 20, str. 2, Moscow, 117246
Воробьев Иван Иванович – кандидат химических наук, доцент, зав. лабораторией биоинженерии клеток млекопитающих.
Пр. 60-летия Октября, 7, корп. 1, Москва, 117312
Vorobiev Ivan Ivanovich – PhD, Associate Professor, Head of Laboratory of Bioengineering of Mammalian Cells.
Pr. 60-letiya Oktyabrya, 7, korp. 1, Moscow, 117312
The aim of the study was to obtain the cell line secreting the maximum amounts of the human luteinizing hormone (LH) heterodimer without significant amounts of free LH alpha-subunit.
Materials and methods. A pair of original plasmids of the p1.1 family containing long non coding segments of the Chinese hamster translation elongation factor 1 alpha gene and a fragment of the concatemer of the Epstein-Barr virus long terminal repeat were used for the persistent expression of human LH subunit genes in Chinese hamster ovary cells. The open reading frame areas of the LH subunits genes were cloned into vectors with the dihydrofolate reductase (DHFR) or glutamine synthase (GS) genes, transfected into the cells, and amplified by methotrexate; following the final procedure of limiting dilution, clonal producer cells were obtained.
Results. For a pair of plasmids, where the LH alpha subunit gene was associated with GS and the beta subunit gene was associated with DHFR, the rate of LH production by the initial stably transfected cell population was 0.1 pg/cell/day and the doubling time was 37 hours, for the reverse pair of plasmids – 0.3 pg/cell/day and 48 hours, respectively. For the initial cell population and for their clonal lines, we used increasing concentrations of methotrexate to amplify the genetic cassettes in the cell genome. In the polyclonal population an increase in the cell productivity up to 2.2 μg/106 cells was observed at a concentration of methotrexate 8 μM; for the clonal lines – a significant productivity increase up to 0.09 μg/106 cells was achieved in only one of six cell lines. Conclusion. Cell lines secreting significant amounts of heterodimeric LH without a significant admixture of free subunit can be obtained using a pair of plasmid vectors encoding the LH subunit genes and the selection markers DHFR or GS. Co-transfection of the plasmids and their subsequent amplification in the genome of producer cells under the selective pressure of methotrexate results in a significant increase in the biosynthesis rate of both LH subunits. The present study provides a rationale for a potential use of these lines in the industrial production of human luteinizing hormone.
Цель исследования: получение линии клеток, секретирующих максимальные количества лютеинизирующего гормона человека (ЛГ) в форме гетеродимера при отсутствии значимых количеств свободной альфа-субъединицы гормона.
Материалы и методы. Для согласованной экспрессии генов субъединиц ЛГ человека в клетках яичника китайского хомячка использовали пару оригинальных плазмид семейства p1.1, содержащих протяженные некодирующие области гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка и фрагмент конкатемера длинного концевого повтора вируса Эпштейна-Барр. Области открытых рамок считывания генов субъединиц ЛГ клонировали в векторы с генами дигидрофолатредуктазы (DHFR) или глутаминсинтазы (GS), трансфицировали в клетки, амплифицировали под действием метотрексата и получали клональные линии-продуценты методом предельных разведений.
Результаты. Для пары плазмид, в которой ген альфа-субъединицы связан с GS, а ген бета-субъединицы – с DHFR, удельная продуктивность первичной стабильно трансфицированной популяции клеток составила 0,1 пг/клетка/день при времени деления клеток 37 часов, а для обратной пары плазмид – 0,3 пг/клетка/день и 48 часов. Для первой популяции клеток и для полученных из нее клональных линий была проведена амплификация генетических кассет в геноме клеток под действием возрастающих концентраций метотрексата. Для поликлональной популяции было зафиксировано возрастание продуктивности клеток до 2,2 мкг/106 клеток по достижении концентрации метотрексата 8 мкМ; для клональных линий клеток многократное возрастание продуктивности до значения 0,09 мкг/106 клеток было зафиксировано только для одной линии из шести после одного шага амплификации.
Заключение. Потенциально промышленно пригодные клеточные линии, секретирующие значительные количества гетеродимерного ЛГ без значимой примеси свободной субъединицы, могут быть получены при помощи пары плазмидных векторов, кодирующих гены субъединиц ЛГ и селекционные маркеры DHFR или GS. Ко-трансфекция плазмид и последующая их амплификация в геноме клеток-продуцентов под действием метотрексата позволяет многократно увеличить уровень биосинтеза обеих субъединиц ЛГ.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.